Aká metóda sa používa v cytológii. Cytológia – veda o bunke Moderné metódy výskumu. Bunková úroveň organizácie života

Základy cytológie

Bunka. Bunková teória.

Bunka- najmenšia štruktúra schopná samoreprodukcie. Termín „bunka“ zaviedol R. Hooke v roku 1665 (pod mikroskopom študoval rez stonky bazy bazy - jadro a korok; hoci Hooke sám nevidel bunky, ale ich škrupiny). Zlepšenie mikroskopickej technológie umožnilo odhaliť rozmanitosť tvarov buniek, zložitosť štruktúry jadra, proces bunkového delenia atď. Mikroskop zdokonalil Antony van Leeuwenhoek (jeho mikroskopy dávali prírastok 270- 300-krát).

Ďalšie metódy bunkového výskumu:

1. diferenciálne odstreďovanie- vychádza zo skutočnosti, že rôzne bunkové štruktúry majú rôznu hustotu. Pri veľmi rýchlej rotácii v zariadení (ultracentrifúge) sa z roztoku vyzrážajú organely jemne pomletých buniek, usporiadané vo vrstvách podľa ich hustoty. Tieto vrstvy sú oddelené a študované.
2. elektrónová mikroskopia- používa sa od 30. rokov 20. storočia (kedy bol vynájdený elektrónový mikroskop - dáva zväčšenie až 10 6-násobok); pomocou tejto metódy študujú štruktúru najmenších štruktúr bunky vr. jednotlivé organely a membrány.
3. autorádiografia- metóda, ktorá umožňuje analyzovať lokalizáciu látok označených rádioaktívnymi izotopmi v bunkách. Takto sa odhaľujú miesta syntézy látok, zloženie bielkovín a spôsoby vnútrobunkového transportu.
4. mikroskopia s fázovým kontrastom- používa sa na štúdium priehľadných bezfarebných predmetov (živých buniek). Pri prechode takýmto médiom sú svetelné vlny posunuté o množstvo určené hrúbkou materiálu a rýchlosťou svetla, ktoré ním prechádza. Mikroskop s fázovým kontrastom prevádza tieto posuny na čiernobiely obraz.
5. rôntgenová difrakčná analýza- štúdium bunky pomocou röntgenových lúčov.

V rokoch 1838-1839. botanik Matthias Schleiden a fyziológ Theodor Schwann vytvorili bunkovej teórie. Jeho podstatou bolo, že hlavným stavebným prvkom všetkých živých organizmov (rastlín a živočíchov) je bunka.

1. bunka – elementárna živý systém; základom stavby, života, rozmnožovania a individuálneho vývoja organizmov.
2. bunky rôznych telesných tkanív a bunky všetkých organizmov sú podobné štruktúrou a chemickým zložením.
3. nové bunky vznikajú len delením už existujúcich buniek.
4. rast a vývoj akéhokoľvek mnohobunkového organizmu je dôsledkom rastu a reprodukcie jednej alebo viacerých počiatočných buniek.

Molekulárne zloženie bunky.

Chemické prvky, ktoré tvoria bunky a vykonávajú akúkoľvek funkciu, sa nazývajú biogénne. Podľa obsahu prvkov, ktoré tvoria bunku, sú rozdelené do troch skupín:

1. makronutrienty- tvoria väčšinu bunky - 99%. Z toho 98% pripadá na 4 prvky: C, O, H a N. Do tejto skupiny patrí aj K, Mg, Ca, P, C1, S, Na, Fe.
2. stopové prvky- patria sem najmä ióny, ktoré sú súčasťou enzýmov, hormónov a iných látok. Ich koncentrácia je od 0,001 do 0,000001 % (B, Cu, Zn, Br, I, Mo atď.).
3. ultramikroelementy- ich koncentrácia nepresahuje 10 -6% a fyziologická úloha nie je odhalená (Au, Ag, U, Ra).

Chemické zložky živých vecí sa delia na anorganické(voda, minerálne soli) a organické(bielkoviny, sacharidy, lipidy, nukleové kyseliny, vitamíny).

Voda. Až na pár výnimiek (kostná a zubná sklovina) je prevládajúcou zložkou buniek voda – v priemere 75 – 85 %. V bunke je voda vo voľnom a viazanom stave. Molekula vody je dipól- na jednom konci je negatívny náboj, na druhom - pozitívny, ale vo všeobecnosti je molekula elektricky neutrálna. Voda má vysokú tepelnú kapacitu a relatívne vysokú tepelnú vodivosť pre kvapaliny.

Biologický význam vody: univerzálne rozpúšťadlo (pre polárne látky sa nepolárne látky vo vode nerozpúšťajú); prostredie pre reakcie, účastník reakcií (rozklad bielkovín), podieľa sa na udržiavaní tepelnej rovnováhy bunky; zdroj kyslíka a vodíka počas fotosyntézy; hlavný dopravný prostriedok látok v tele.

Ióny a soli. Soli sú súčasťou kostí, škrupín, škrupín atď., t.j. vykonávajú podporné a ochranné funkcie a podieľajú sa aj na metabolizme minerálov. Ióny sú súčasťou rôznych látok (železo – hemoglobín, chlór – kyselina chlorovodíková v žalúdku, horčík – chlorofyl) a podieľajú sa na regulačných a iných procesoch, ako aj na udržiavaní homeostázy.

Veveričky. Podľa obsahu v bunke sú na prvom mieste organickej hmoty. Proteíny sú nepravidelné polyméry zložené z aminokyselín. Proteíny sa skladajú z 20 rôznych aminokyselín. Aminokyselina:

NH2-CH-COOH | R

Spojenie aminokyselín prebieha nasledovne: aminoskupina jednej kyseliny sa spojí s karboxylovou skupinou druhej a uvoľní sa molekula vody. Výsledné spojenie je tzv peptid(druh kovalentnej látky) a samotná zlúčenina - peptid. Zlúčenina mnohých aminokyselín je tzv polypeptid. Ak sa proteín skladá len z aminokyselín, potom sa nazýva jednoduchý ( proteín), ak zahŕňa iné látky, potom komplexné ( proteín).

Priestorová organizácia proteínov zahŕňa 4 štruktúry:

1. Primárny(lineárny) - polypeptidový reťazec, t.j. reťazec aminokyselín spojených kovalentnými väzbami.
2. Sekundárne- proteínová niť je stočená do špirály. Vytvára vodíkové väzby.
3. treťohorný- špirála sa ďalej zvíja a vytvára globulu (závitok) alebo fibrilu (predĺžená štruktúra). Vznikajú v ňom hydrofóbne a elektrostatické interakcie a tiež kovalentné disulfidové -S-S- väzby.
4. kvartér- spojenie viacerých makromolekúl bielkovín dohromady.

Rozpad bielkovinovej štruktúry je tzv denaturácia. Môže byť nevratná (ak je poškodená primárna štruktúra) alebo reverzibilná (ak sú poškodené iné štruktúry).

Funkcie bielkovín:

1. enzýmy sú biologicky aktívne látky, katalyzujú chemické reakcie. Je známych viac ako 2000 enzýmov. Vlastnosti enzýmov: špecifickosť účinku (každý pôsobí len na určitú látku - substrát), aktivita len v určitom prostredí (každý enzým má svoje optimálne rozmedzie pH) a pri určitej teplote (so stúpajúcou teplotou sa zvyšuje pravdepodobnosť denaturácie). zvyšuje, takže aktivita enzýmu klesá), väčšia účinnosť akcie s malým obsahom. Každý enzým má aktívne centrum- ide o špeciálne miesto v štruktúre enzýmu, ku ktorému je pripojená molekula substrátu. V súčasnosti sa enzýmy na základe štruktúry delia na dve hlavné skupiny: plne bielkovinové enzýmy a enzýmy pozostávajúce z dvoch častí: apoenzým (bielkovinová časť) a koenzým (nebielkovinová časť; ide o ión alebo molekulu, ktorá sa viaže na bielkovinovú časť). tvoriaci katalyticky aktívny komplex). Koenzýmy sú kovové ióny, vitamíny. Bez koenzýmu apoenzým nefunguje.
2. regulačné – hormóny.
3. transport – hemoglobín.
4. ochranné - imunoglobulíny (protilátky).
5. pohyb - aktín, myozín.
6. stavebné (konštrukčné).
7. energie - extrémne zriedkavo, až po skonzumovaní sacharidov a lipidov.

Sacharidy- organické látky, ktoré zahŕňajú C, O a H. Všeobecný vzorec: C n (H 2 O) n, kde n je najmenej 3. Delia sa do 3 tried: monosacharidy, disacharidy (oligosacharidy) a polysacharidy.

Monosacharidy(jednoduché sacharidy) - pozostávajú z jednej molekuly, sú to pevné kryštalické látky, vysoko rozpustné vo vode, sladkej chuti. Ribóza a deoxyribóza(C 5) - sú súčasťou DNA a RNA. Glukóza(C 6 H 12 O 6) - je súčasťou polysacharidov; hlavný primárny zdroj energie v bunke. Fruktóza a galaktóza izoméry glukózy.

Oligosacharidy- pozostávajú z 2, 3 alebo 4 monosacharidových zvyškov. Najdôležitejší disacharidy- pozostávajú z 2 zvyškov; vysoko rozpustný vo vode, sladkej chuti. sacharóza(C 12 H 22 O 11) - pozostáva z glukózových a fruktózových zvyškov; široko rozšírené v rastlinách. Laktóza (mliečny cukor)- pozostáva z glukózy a galaktózy. Najdôležitejší zdroj energie pre mláďatá cicavcov. maltóza- pozostáva z 2 molekúl glukózy. Je to hlavný štrukturálny prvok škrobu a glykogénu.

Polysacharidy- makromolekulárne látky, pozostávajúce z veľkého počtu monosacharidových zvyškov. Zle rozpustný vo vode, nemá sladkú chuť. škrob- Predstavujú ho dve formy: amylóza (pozostáva z glukózových zvyškov spojených nerozvetveným reťazcom) a amylopektín (pozostáva z glukózových zvyškov, lineárnych a rozvetvených reťazcov). Glykogén- polysacharid živočíchov a húb. Štruktúrou pripomína škrob, ale je viac rozvetvený. Vláknina (celulóza)- hlavný štruktúrny polysacharid rastlín, je súčasťou bunkových stien. Je to lineárny polymér.

Funkcie uhľohydrátov:

1. energie - 1 g pri úplnom rozpade dáva 17,6 kJ.
2. Štrukturálne.
3. Podpora (v rastlinách).
4. Prísun živín (škrob a glykogén).
5. Ochranné - viskózne sekréty (hlien) sú bohaté na sacharidy a chránia steny dutých orgánov.

Lipidy- kombinovať tuky a tukom podobné látky - lipoidy. Tuky sú estery mastných kyselín a glycerolu. Mastné kyseliny: palmitová, stearová (nasýtená), olejová (nenasýtená). Rastlinné tuky sú bohaté na nenasýtené kyseliny, preto sú pri izbovej teplote taviteľné, tekuté. Živočíšne tuky obsahujú najmä nasýtené kyseliny, preto sú žiaruvzdornejšie, pri izbovej teplote – tuhé. Všetky tuky sú nerozpustné vo vode, ale ľahko rozpustné v nepolárnych rozpúšťadlách; zle vedie teplo. Tuky sú fosfolipidy(to je hlavná zložka bunkových membrán) - zahŕňajú zvyšok kyseliny fosforečnej. Lipoidy zahŕňajú steroidy, vosky atď.

Funkcie lipidov:

1. štrukturálne
2. energie - 1 g pri úplnom rozpade dáva 38,9 kJ.
3. Ukladanie živín (tukové tkanivo)
4. Termoregulácia (podkožný tuk)
5. Dodávatelia endogénnej vody - pri oxidácii 100 g tuku sa uvoľní 107 ml vody (princíp ťavy)
6. Ochrana vnútorných orgánov pred poškodením
7. Hormóny (estrogény, androgény, steroidné hormóny)
8. Prostaglandíny sú regulačné látky, ktoré udržiavajú tonus ciev a hladkého svalstva a podieľajú sa na imunitných reakciách.

ATP (adenozíntrifosfát). Energia uvoľnená pri rozklade organických látok sa nevyužíva hneď na prácu v bunkách, ale najskôr sa ukladá vo forme vysokoenergetickej zlúčeniny – ATP. ATP sa skladá z troch zvyškov kyseliny fosforečnej, ribózy (monosacharid) a adenínu (zvyšok dusíkatej bázy). Keď sa odštiepi jeden zvyšok kyseliny fosforečnej, vytvorí sa ADP, a ak sa odštiepia dva zvyšky, vytvorí sa AMP. Štiepna reakcia každého zvyšku je sprevádzaná uvoľnením 419 kJ/mol. Táto väzba fosfor-kyslík v ATP sa nazýva makroergický. ATP má dve makroergické väzby. ATP vzniká v mitochondriách z AMP, na ktorý sa najprv pripojí jeden, potom druhý zvyšok kyseliny fosforečnej s absorpciou 419 kJ/mol energie (alebo z ADP s prídavkom jedného zvyšku kyseliny fosforečnej).

Príklady energeticky náročných procesov: biosyntéza bielkovín.

Nukleové kyseliny- Ide o vysokomolekulárne organické zlúčeniny, ktoré zabezpečujú uchovávanie a prenos dedičných informácií. Prvýkrát opísaný v 19. storočí (1869) Švajčiarom Friedrichom Miescherom. Existujú dva typy nukleových kyselín.

DNA (deoxyribonukleová kyselina)

Obsah v klietke je prísne konštantný. Nachádza sa najmä v jadre (kde tvorí chromozómy pozostávajúce z DNA a dvoch typov proteínov). DNA je nepravidelný biopolymér, ktorého monomér je nukleotid pozostávajúci z dusíkatej bázy, zvyšku kyseliny fosforečnej a monosacharidu deoxyribózy. V DNA sú 4 typy nukleotidov: A (adenín), T (tymín), G (guanín) a C (cytozín). A a G sú purínové zásady, C a T sú pyrimidínové zásady. Zároveň sa v DNA počet purínových báz rovná počtu pyrimidínových báz, ako aj A \u003d T a C \u003d G (Chargaffovo pravidlo).

V roku 1953 J. Watson a F. Crick zistili, že molekula DNA je dvojitá špirála. Každá špirála pozostáva z polynukleotidového reťazca; reťazce sú skrútené jeden okolo druhého a spolu okolo spoločnej osi, každá otáčka špirály obsahuje 10 párov nukleotidov. Reťazce sú držané pohromade vodíkovými väzbami, ktoré vznikajú medzi bázami (medzi A a T - dve, medzi C a G - tri väzby). Polynukleotidové reťazce sú navzájom komplementárne: oproti adenínu v jednom reťazci je vždy tymín v druhom a naopak (A-T a T-A); opačný cytozín - guanín (C-G a G-C). Tento princíp štruktúry DNA sa nazýva princíp komplementarity alebo komplementarity.

Každý reťazec DNA má špecifickú orientáciu. Dve vlákna v molekule DNA sú umiestnené v opačnom smere, t.j. antiparalelné.

Hlavnou funkciou DNA je uchovávanie a prenos dedičných informácií.

RNA (ribonukleová kyselina)

1. i-RNA (messenger RNA) – obsiahnutá v jadre a cytoplazme. Jeho funkciou je preniesť informácie o štruktúre proteínu z DNA do miesta syntézy proteínov.
2. t-RNA (transferová RNA) – hlavne v cytoplazme bunky. Funkcia: transport molekúl aminokyselín do miesta syntézy bielkovín. Toto je najmenšia RNA.
3. r-RNA (ribozomálna RNA) – podieľa sa na tvorbe ribozómov. Toto je najväčšia RNA.

Bunková štruktúra.

Hlavnými zložkami bunky sú: vonkajšia bunková membrána, cytoplazma a jadro.

Membrána. V zložení biologickej membrány ( plazmalema) zahŕňa lipidy, ktoré tvoria základ membrány a vysokomolekulárne proteíny. Molekuly lipidov sú polárne a pozostávajú z polárnych hydrofilných hláv nesúcich náboj a nepolárnych hydrofóbnych chvostov (mastných kyselín). Membrána obsahuje hlavne fosfolipidy(majú vo svojom zložení zvyšok kyseliny fosforečnej). Membránové proteíny môžu byť povrchný, integrálne(prenikajú cez membránu) a polointegrálne(ponorené v membráne).

Moderný model biologickej membrány je tzv "Univerzálny model tekutej mozaiky", podľa ktorého sú globulárne proteíny ponorené do dvojitej lipidovej vrstvy, pričom niektoré proteíny ňou prenikajú cez, iné čiastočne. Predpokladá sa, že integrálne proteíny sú amfifilné, ich nepolárne oblasti sú ponorené do lipidovej dvojvrstvy a polárne vyčnievajú smerom von a vytvárajú hydrofilný povrch.

Submembránový bunkový systém (submembránový komplex). Je to špecializovaná periférna časť cytoplazmy a zaujíma hraničnú polohu medzi pracovným metabolickým aparátom bunky a plazmatickou membránou. V submembránovom systéme povrchového aparátu možno rozlíšiť dve časti: periférne hyaloplazma, kde sú koncentrované enzymatické systémy spojené s procesmi transmembránového transportu a príjmu, a štrukturálne pohybového aparátu. Muskuloskeletálny systém pozostáva z mikrofibríl, mikrotubulov a skeletálnych fibrilárnych štruktúr.

Nadmembránové štruktúry eukaryotické bunky možno rozdeliť do dvoch širokých kategórií.

1. Vlastný supramembránový komplex, alebo glykokalyx Hrúbka 10-20 nm. Pozostáva z proteínov periférnej membrány, sacharidových častí glykolipidov a glykoproteínov. Glykokalyx hrá dôležitá úloha vo funkcii receptora zabezpečuje „individualizáciu“ bunky – obsahuje receptory tkanivovej kompatibility.
2. Deriváty supramembránových štruktúr. Patria sem špecifické chemické zlúčeniny, ktoré samotná bunka nevytvára. Najlepšie sa študujú na mikroklkoch črevných epiteliálnych buniek cicavcov. Tu sú to hydrolytické enzýmy adsorbované z črevnej dutiny. Ich prechodom zo suspendovaného do fixného stavu sa vytvára základ pre kvalitatívne odlišný typ trávenia, takzvané parietálne trávenie. Ten vo svojej podstate zaujíma medziľahlú polohu medzi dutinou a intracelulárnou.

Funkcie biologickej membrány:

1. bariéra;
2. receptor;
3. bunková interakcia;
4. udržiavanie tvaru bunky;
5. enzymatická aktivita;
6. transport látok do bunky a z bunky.

Membránový transport:

1. pre mikromolekuly. Rozlišujte medzi aktívnym a pasívnym transportom.

   Komu pasívny zahŕňajú osmózu, difúziu, filtráciu. Difúzia- transport látky smerom k nižšej koncentrácii. Osmóza- pohyb vody smerom k roztoku s vyššou koncentráciou. Pomocou pasívneho transportu sa látky rozpustné vo vode a v tukoch pohybujú.

   Komu aktívny transport zahŕňajú: prenos látok za účasti nosných enzýmov a iónových púmp. Nosný enzým naviaže prenesenú látku a „vtiahne“ ju do bunky. Mechanizmus iónovej pumpy je uvažovaný na príklade prevádzky draslíkovo-sodná pumpa: pri jeho prevádzke sa z článku prenesú tri Na + na každé dva K + do článku. Pumpa funguje na princípe otvárania a zatvárania kanálov a svojou chemickou podstatou je proteín-enzým (štiepi ATP). Proteín sa viaže na ióny sodíka, mení svoj tvar a v jeho vnútri sa vytvára kanál na prechod iónov sodíka. Po prechode cez tieto ióny proteín opäť zmení tvar a otvorí sa kanál, cez ktorý prechádzajú draselné ióny. Všetky procesy sú energeticky závislé.

   Zásadný rozdiel medzi aktívnou dopravou a pasívnou dopravou je v tom, že je spojená s nákladmi na energiu, zatiaľ čo pasívna doprava nie.

2. pre makromolekuly. Vyskytuje sa pomocou aktívneho zachytávania látok bunkovou membránou: fagocytóza a pinocytóza. Fagocytóza- zachytávanie a absorpcia veľkých častíc bunkou (napríklad ničenie patogénnych mikroorganizmov makrofágmi ľudského tela). Prvýkrát opísaný I.I. Mečnikov. pinocytóza- proces zachytávania a absorpcie kvapôčok kvapaliny bunkou s látkami v nej rozpustenými. Oba procesy prebiehajú podľa podobného princípu: na povrchu bunky je látka obklopená membránou vo forme vakuoly, ktorá sa pohybuje dovnútra. Oba procesy sú spojené so spotrebou energie.

Cytoplazma. V cytoplazme sa rozlišuje hlavná látka (hyaloplazma, matrica), organely (organely) a inklúzie.

Základná látka vypĺňa priestor medzi plazmalemou, jadrovou membránou a inými vnútrobunkovými štruktúrami. Tvorí vnútorné prostredie bunky, ktoré spája všetky vnútrobunkové štruktúry a zabezpečuje ich vzájomnú interakciu. Cytoplazma sa správa ako koloid schopný prejsť z gélového stavu do sólu a naopak. Sol- je to stav hmoty charakterizovaný nízkou viskozitou a bez zosieťovania medzi mikrovláknami. Gél- je to stav hmoty charakterizovaný vysokou viskozitou a prítomnosťou väzieb medzi mikrovláknami. Vonkajšia vrstva cytoplazmy alebo ektoplazmy má vyššiu hustotu a je bez granúl. Príklady procesov prebiehajúcich v matrici: glykolýza, rozklad látok na monoméry.

organely- štruktúry cytoplazmy, ktoré v bunke vykonávajú špecifické funkcie.

Organely sú:

1. membránové (jedno- a dvojmembránové (mitochondrie a plastidy)) a nemembránové.
2. organely všeobecného významu a špeciálne. Medzi prvé patria: ER, Golgiho aparát, mitochondrie, ribozómy a polyzómy, lyzozómy, bunkové centrum, mikrotelieska, mikrotubuly, mikrofilamenty. Organely špeciálneho určenia (prítomné v bunkách, ktoré vykonávajú špecializované funkcie): mihalnice a bičíky (pohyb buniek), mikroklky, synaptické vezikuly, myofibrily.

Bunkové inklúzie- sú to nestále útvary, buď vznikajúce alebo zanikajúce v procese života bunky, t.j. sú produktmi bunkového metabolizmu. Najčastejšie sa nachádzajú v cytoplazme, menej často v organelách alebo v jadre. Inklúzie sú zastúpené najmä granulami (polysacharidy: glykogén u zvierat, škrob v rastlinách; menej často proteíny - v cytoplazme vajec), kvapky (lipidy) a kryštály (šťavelan vápenatý). Medzi bunkové inklúzie patria aj niektoré pigmenty – žltý a hnedý lipofuscín (hromadí sa pri starnutí buniek), retinín (súčasť zrakového pigmentu), hemoglobín, melanín atď.

Jadro. Hlavnou funkciou jadra je uchovávanie dedičných informácií. Zložkami jadra sú jadrová membrána, nukleoplazma (jadrová šťava), jadierko (jeden alebo dva), zhluky chromatínu (chromozómy). Jadrová membrána eukaryotickej bunky oddeľuje dedičný materiál (chromozómy) od cytoplazmy, v ktorej prebiehajú rôzne metabolické reakcie. Jadrový obal pozostáva z 2 biologických membrán. V určitých intervaloch sa obe membrány navzájom spájajú a vytvárajú sa póry sú otvory v jadrovej membráne. Prostredníctvom nich dochádza k metabolizmu s cytoplazmou.

základ nukleoplazma tvoria proteíny, vrátane fibrilárnych. Obsahuje enzýmy potrebné na syntézu nukleových kyselín a ribozómov. Jadrová šťava obsahuje aj RNA.

Nucleoli- toto je miesto montáže ribozómov, sú to nestále štruktúry jadra. Zmiznú na začiatku bunkového delenia a znovu sa objavia na jeho konci. V jadierku sa rozlišuje amorfná časť a nukleárne vlákno. Obe zložky sú postavené z vlákien a granúl, ktoré pozostávajú z bielkovín a RNA.

Chromozómy. Chromozómy sú tvorené DNA obklopenou dvoma typmi proteínov: histón(hlavný) a nonhistone(kyslé). Chromozómy môžu byť v dvoch štrukturálnych a funkčných stavoch: špirálovito a despiralizovaný. Čiastočne alebo úplne dekondenzovaný (despiralizovaný) stav sa nazýva pracovný stav, pretože v tomto stave nastávajú procesy transkripcie a reduplikácie. Neaktívny stav – v stave metabolického pokoja pri ich maximálnej kondenzácii, kedy plnia funkciu distribúcie a prenosu genetického materiálu do dcérskych buniek.

AT medzifázou Chromozómy sú reprezentované guľôčkou tenkých vlákien, ktoré sú rozlíšiteľné iba pod elektrónovým mikroskopom. Pri delení sa chromozómy skracujú a hrubnú, sú špirálovité a dobre viditeľné pod mikroskopom (najlepšie v štádiu metafázy). V tomto čase sa chromozómy skladajú z dvoch chromatíd spojených primárnym zúžením, ktoré rozdeľuje každú chromatídu na dve časti - ramená.

Podľa umiestnenia primárnej konstrikcie sa rozlišuje niekoľko typov chromozómov:

1. metacentrický alebo rovnaké ramená (obe ramená chromozómu majú rovnakú dĺžku);
2. submetacentrické alebo nerovnaké ramená (ramená chromozómu sa trochu líšia veľkosťou);
3. akrocentrický(jedna ruka je veľmi krátka).

bunkový metabolizmus.

To je jedna zo základných vlastností živých vecí. Metabolizmus je možný vďaka tomu, že živé organizmy sú otvorené systémy, t.j. Medzi organizmom a prostredím prebieha neustála výmena hmoty a energie. Metabolizmus prebieha vo všetkých orgánoch, tkanivách a bunkách, pričom zabezpečuje samoobnovu morfologických štruktúr a chemického zloženia cytoplazmy.

Metabolizmus pozostáva z dvoch procesov: asimilácie (alebo výmeny plastov) a disimilácie (alebo výmeny energie). Asimilácia(výmena plastov) - súhrn všetkých procesov biosyntézy prebiehajúcich v živých organizmoch. Disimilácia(energetický metabolizmus) - súhrn všetkých procesov rozkladu zložitých látok na jednoduché s uvoľňovaním energie, ktoré prebiehajú v živých organizmoch.

Podľa spôsobu asimilácie a v závislosti od druhu použitej energie a východiskových látok sa organizmy delia na autotrofy (fotosyntetiká a chemosyntetiká) a heterotrofy. Autotrofy- Sú to organizmy, ktoré nezávisle syntetizujú organické látky, pričom na to využívajú energiu Slnka ( fotoautotrofy) alebo energiu oxidácie anorganických látok ( chemoautotrofy). Autotrofy zahŕňajú rastliny, baktérie, modrozelené. Heterotrofy- Sú to organizmy, ktoré spolu s jedlom prijímajú hotové organické látky. Patria sem zvieratá, huby, baktérie.

Úloha autotrofov v obehu látok je obrovská: 1) transformujú energiu Slnka na energiu chemických väzieb organických látok, ktorú využívajú všetky ostatné živé bytosti na našej planéte; 2) nasýtenie atmosféry kyslíkom (fotoautotrofy), ktoré je pre väčšinu heterotrofov nevyhnutné na získanie energie oxidáciou organických látok. Heterotrofy tiež zohrávajú dôležitú úlohu v kolobehu látok: uvoľňujú anorganické látky (oxid uhličitý a vodu), ktoré využívajú autotrofy.

Disimilácia. Všetky heterotrofné organizmy dostávajú energiu v dôsledku redoxných reakcií, t.j. také, pri ktorých sa elektróny prenášajú z donorov-reduktorov elektrónov na akceptory elektrónov - oxidátory.

Výmena energie aeróbne organizmy pozostáva z troch etáp:

1. prípravný, ktorý prechádza v gastrointestinálnom trakte alebo v bunke pôsobením lyzozómových enzýmov. Počas tohto štádia sa všetky biopolyméry rozkladajú na monoméry: proteíny sa najskôr rozkladajú na peptidy, potom na aminokyseliny; tuky - na glycerol a mastné kyseliny; sacharidy - na monosacharidy (na glukózu a jej izoméry).
2. anoxický(alebo anaeróbne), ktorá prebieha v matrici cytoplazmy. Táto etapa je tzv glykolýza. Pôsobením enzýmov sa glukóza rozkladá na dve molekuly PVC. V tomto prípade sa uvoľnia 4 atómy H, ktoré prijíma látka nazývaná NAD + (nikotínamid adenín dinukleotid). Súčasne sa NAD + obnoví na NAD * H (táto uložená energia sa neskôr použije na syntézu ATP). Taktiež v dôsledku rozkladu glukózy vznikajú z ADP 4 molekuly ATP. Súčasne sa pri chemických reakciách glykolýzy spotrebujú 2 molekuly ATP, takže celkový výťažok ATP po glykolýze sú 2 molekuly ATP.
3. kyslík ktorý sa odohráva v mitochondriách. Dve molekuly PVC vstupujú do enzymatického kruhového „dopravníka“, ktorý sa nazýva Krebsov cyklus alebo cyklus trikarboxylových kyselín. Všetky enzýmy tohto cyklu sa nachádzajú v mitochondriách.

V mitochondriách sa PVC oxiduje a premieňa na energeticky bohatú látku - acetyl koenzým A(je to derivát kyseliny octovej). Ďalej táto látka reaguje so šťukou, pričom vzniká kyselina citrónová (citrát), koenzým A, protóny (prijímané NAD+, ktoré sa menia na NAD * H) a oxid uhličitý. Následne sa kyselina citrónová oxiduje a opäť sa mení na PEA, ktorý reaguje s novou molekulou acetylkoenzýmu A a celý cyklus sa opakuje odznova. Počas tohto procesu sa energia ukladá vo forme ATP a NAD*H.

Ďalšou fázou je premena energie uloženej v NAD * H na energiu väzieb ATP. Počas tohto procesu sa elektróny z NAD*H pohybujú po viackrokovom reťazci elektrónového transportu ku konečnému akceptoru, molekulárnemu kyslíku. Keď sa elektróny pohybujú z kroku na krok, uvoľňuje sa energia, ktorá sa používa na premenu ADP na ATP. Keďže v tomto procese je oxidácia spojená s fosforyláciou, celý proces sa nazýva Oxidačná fosforylácia(Tento proces objavil ruský vedec V.A. Engelhardt; vyskytuje sa na vnútornej membráne mitochondrií). Na konci tohto procesu sa tvorí voda. Počas kyslíkového štádia sa vytvorí 36 molekúl ATP.

Konečnými produktmi rozkladu glukózy sú teda oxid uhličitý a voda. Pri úplnom rozpade jednej molekuly glukózy sa uvoľní 38 molekúl ATP. Pri nedostatku kyslíka v bunke sa glukóza oxiduje za tvorby kyseliny mliečnej (napríklad pri intenzívnej svalovej práci - behu atď.). V dôsledku toho sa vytvoria iba dve molekuly ATP.

Je potrebné poznamenať, že nielen molekuly glukózy môžu slúžiť ako zdroj energie. Mastné kyseliny sa v bunke tiež oxidujú na acetyl koenzým A, ktorý vstupuje do Krebsovho cyklu; zároveň sa NAD + obnoví na NAD * H, ktorý sa podieľa na oxidatívnej fosforylácii. Pri akútnom nedostatku glukózy a mastných kyselín v bunke mnohé aminokyseliny podliehajú oxidácii. Tvoria tiež acetyl koenzým A alebo organické kyseliny zapojené do Krebsovho cyklu.

o metóda anaeróbnej disimilácie neexistuje kyslíkové štádium a energetický metabolizmus v anaeróboch sa nazýva „fermentácia“. Konečnými produktmi disimilácie počas fermentácie sú kyselina mliečna (baktérie mliečneho kvasenia) alebo etylalkohol (droždie). Pri tomto type metabolizmu sa z jednej molekuly glukózy uvoľňujú 2 molekuly ATP.

Aeróbne dýchanie je teda takmer 20-krát energeticky prospešnejšie ako anaeróbne dýchanie.

Fotosyntéza.Život na Zemi je úplne závislý od fotosyntézy rastlín, ktorá dodáva organickú hmotu a O 2 všetkým organizmom. Fotosyntéza premieňa svetelnú energiu na energiu chemickej väzby.

Fotosyntéza- ide o tvorbu organických látok z anorganických za účasti slnečnej energie. Tento proces objavil K.A. Timiryazev v 19. storočí. Rovnica celkovej fotosyntézy: 6CO2 + 6H20 \u003d C6H1206 + 6O2.

Fotosyntéza sa uskutočňuje v rastlinách, ktoré majú plastidy - chloroplasty. Chloroplasty majú dve membrány, vo vnútri - matricu. Majú dobre vyvinutú vnútornú membránu, ktorá má záhyby, medzi ktorými sú bubliny - tylakoidy. Niektoré z tylakoidov sú naukladané do skupín tzv zrná. Granas obsahujú všetky fotosyntetické štruktúry; v stróme obklopujúcej tylakoidy sú enzýmy, ktoré redukujú oxid uhličitý na glukózu. Hlavným pigmentom chloroplastov je chlorofyl, štruktúrou podobná ľudskému hemu. Chlorofyl obsahuje atóm horčíka. Chlorofyl absorbuje modré a červené lúče spektra a odráža zelené. Môžu byť prítomné aj iné pigmenty: žlté karotenoidy a červené alebo modré fykobilíny. Karotenoidy sú maskované chlorofylom; absorbujú svetlo nedostupné pre iné pigmenty a prenášajú ho do chlorofylu.

Chloroplasty obsahujú dva fotosystémy rôznej štruktúry a zloženia: fotosystém I a II. Fotosystém I má reakčné centrum, čo je molekula chlorofylu v komplexe so špecifickým proteínom. Tento komplex absorbuje svetlo s vlnovou dĺžkou 700 nm (preto sa nazýva fotochemické centrum P700). Fotosystém II má tiež reakčné centrum, fotochemické centrum P680.

Fotosyntéza má dve fázy: svetlo a tmu.

svetelné javisko. Energia svetla je absorbovaná chlorofylom a uvádza ho do excitovaného stavu. Elektrón vo fotochemickom centre P700 absorbuje svetlo, presunie sa na vyššiu energetickú hladinu a prenesie sa na NADP + (nikotínamid adenín dinukleotid fosfát), čím sa redukuje na NADP*H. V molekule chlorofylu fotosystému I zostávajú „diery“ – nevyplnené miesta pre elektróny. Tieto „diery“ sú vyplnené elektrónmi pochádzajúcimi z fotosystému II. Pôsobením svetla sa elektrón chlorofylu vo fotochemickom centre P680 tiež dostane do excitovaného stavu a začne sa pohybovať po reťazci nosičov elektrónov. Nakoniec tento elektrón prichádza do fotosystému I a zapĺňa voľné miesta v ňom. V tomto prípade elektrón stráca časť energie, ktorá sa vynakladá na tvorbu ATP z ADP.

Aj v chloroplastoch sa pôsobením slnečného žiarenia voda štiepi - fotolýza, pri ktorej vznikajú elektróny (vstupujú do fotosystému II a nahradia elektróny, ktoré prešli do nosného reťazca), protóny (akceptujú sa NADP +) a kyslík (ako vedľajší produkt):

2H20 \u003d 4H++ 4e- + O2

V dôsledku svetelného štádia sa teda akumuluje energia vo forme ATP a NADP * H, ako aj tvorba kyslíka.

temné javisko. Nevyžaduje svetlo. Molekula oxidu uhličitého reaguje s 1,5-ribulózadifosfátom (ide o derivát ribózy) pomocou enzýmov. Vznikne medziproduktová zlúčenina C 6, ktorá sa vodou rozloží na dve molekuly kyseliny fosfoglycerovej (C 3). Z týchto látok sa zložitými reakciami syntetizuje fruktóza, ktorá sa následne premieňa na glukózu. Tieto reakcie vyžadujú 18 molekúl ATP a 12 molekúl NADP*H. Rastliny vyrábajú škrob a celulózu z glukózy. Fixácia CO 2 a jeho premena na sacharidy je cyklická a je tzv Calvinov cyklus.

Význam fotosyntézy pre poľnohospodárstvo veľký - od toho závisí výnos plodín. Pri fotosyntéze rastlina využíva len 1-2% slnečnej energie, takže je tu obrovská perspektíva zvýšenia výnosov výberom odrôd s vyššou fotosyntetickou účinnosťou. Na zvýšenie účinnosti fotosyntézy sa využíva: umelé osvetlenie (dosvetlenie žiarivkami v zamračených dňoch alebo na jar a jeseň) v skleníkoch; nedostatok tienenia pestovaných rastlín, dodržiavanie potrebných vzdialeností medzi rastlinami a pod.

Chemosyntéza. Ide o proces tvorby organických látok z anorganických látok s využitím energie získanej oxidáciou anorganických látok. Táto energia sa ukladá vo forme ATP. Chemosyntézu objavil ruský mikrobiológ S.N. Vinogradsky v 19. storočí (1889-1890). Tento proces je možný v baktériách: sírne baktérie (oxidujú sírovodík na síru a dokonca aj na kyselinu sírovú); nitrifikačné baktérie (oxidujú amoniak na kyselinu dusičnú).

replikácia DNA(zdvojnásobenie DNA). Výsledkom tohto procesu sú dve dvojzávitnice DNA, ktoré sa nelíšia od tej pôvodnej (materskej). Po prvé, pomocou špeciálneho enzýmu (helikázy) sa dvojitá špirála DNA rozkrúti v miestach začiatku replikácie. Potom za účasti enzýmu DNA polymerázy dochádza k syntéze dcérskych reťazcov DNA. Na jednom z reťazcov proces pokračuje nepretržite - tento reťazec sa nazýva vodca. Druhý reťazec DNA sa syntetizuje v krátkych fragmentoch ( fragmenty Okazaki), ktoré sú spolu „zošité“ pomocou špeciálnych enzýmov. Tento reťazec sa nazýva zaostávanie alebo zaostávanie.

Oblasť medzi dvoma bodmi, kde začína syntéza dcérskych reťazcov, sa nazýva replikón. Eukaryoty majú vo svojej DNA veľa replikónov, zatiaľ čo prokaryoty majú iba jeden replikón. V každej replike môžete vidieť replikačná vidlica- tá časť molekuly DNA, ktorá sa už rozmotala.

Replikácia je založená na niekoľkých princípoch:

1. komplementarita (A-T, C-G) antiparalelnosť. Každé vlákno DNA má špecifickú orientáciu: jeden koniec nesie OH skupinu pripojenú k 3" uhlíku v cukrovej deoxyribóze, na druhom konci reťazca je zvyšok kyseliny fosforečnej v 5" polohe cukru. Dve vlákna DNA sú orientované v opačných smeroch, t.j. antiparalelné. Enzým DNA polymeráza sa môže pohybovať pozdĺž templátových reťazcov iba jedným smerom: od ich 3' koncov po 5' konce. Preto v procese replikácie prebieha súčasná syntéza nových reťazcov antiparalelne.
2. polokonzervatívne. Vytvárajú sa dve dcérske helixy, z ktorých každá zachováva (zachováva) jednu z polovíc materskej DNA bez zmeny
3. diskontinuita. Aby sa vytvorili nové vlákna DNA, musia byť rodičovské vlákna úplne rozkrútené a natiahnuté, čo je nemožné; preto replikácia začína súčasne na niekoľkých miestach.

biosyntéza bielkovín. Príkladom metabolizmu plastov v heterotrofných organizmoch je biosyntéza proteínov. Všetky hlavné procesy v tele sú spojené s bielkovinami a v každej bunke prebieha neustála syntéza bielkovín charakteristických pre túto bunku a potrebných v danom období života bunky. Informácie o molekule proteínu sú zakódované v molekule DNA pomocou tripletov alebo kodónov.

Genetický kód je systém na zaznamenávanie informácií o sekvencii aminokyselín v proteínoch pomocou sekvencie nukleotidov v mRNA.

Vlastnosti kódu:

1. Tripletita – každá aminokyselina je zašifrovaná sekvenciou troch nukleotidov. Táto sekvencia sa nazýva triplet alebo kodón.
2. Degenerácia alebo redundancia – každá aminokyselina je zašifrovaná viac ako jedným kodónom (od 2 do 6). Výnimkou sú metionín a tryptofán – každý z nich je kódovaný jedným tripletom.
3. Jednoznačné – každý kodón kóduje len jednu aminokyselinu.
4. Medzi génmi sú "interpunkčné znamienka" - sú to tri špeciálne triplety (UAA, UAG, UGA), z ktorých každý nekóduje aminokyseliny. Tieto triplety sa nachádzajú na konci každého génu. V géne nie sú žiadne „interpunkčné znamienka“.
5. Univerzálnosť – genetický kód je rovnaký pre všetky živé bytosti planéty Zem.

V biosyntéze bielkovín sa rozlišujú tri stupne - transkripcia, posttranskripčné procesy a translácia.

Prepis- ide o proces syntézy mRNA, ktorý vykonáva enzým RNA polymeráza. Vyskytuje sa v jadre. Transkripcia sa vykonáva podľa pravidla komplementarity. Dĺžka mRNA zodpovedá jednému alebo viacerým génom. V procese transkripcie existujú 4 fázy:

1. väzba RNA polymerázy na promótor (toto je miesto na pripojenie enzýmu).
2. iniciácia – začiatok syntézy.
3. predlžovanie - rast reťazca RNA; sekvenčné pripojenie nukleotidov k sebe v poradí, v ktorom sú komplementárne nukleotidy vlákna DNA. Jeho rýchlosť je až 50 nukleotidov za sekundu.
4. terminácia - dokončenie syntézy pre-i-RNA.

post-transkripčné procesy. Po vytvorení pre-mRNA začína dozrievanie alebo spracovanie mRNA. V tomto prípade sa z molekuly RNA odstránia intrónové oblasti, po ktorých nasleduje spojenie exónových oblastí (tento proces je tzv. spájanie). Potom zrelá mRNA opustí jadro a ide do miesta syntézy proteínov (k ribozómom).

Vysielanie- ide o syntézu polypeptidových reťazcov proteínov, ktorú vykonáva templát mRNA v ribozómoch.

Aminokyseliny potrebné na syntézu proteínov sú dodávané do ribozómov prostredníctvom tRNA. Molekula transferovej RNA má tvar ďatelinového listu, na vrchu ktorého je sekvencia troch nukleotidov, ktoré sú komplementárne k nukleotidom kodónu v mRNA. Táto sekvencia sa nazýva antikodón. Enzým (kodáza) rozpoznáva tRNA a pripája k nej zodpovedajúcu aminokyselinu (spotrebuje sa energia jednej molekuly ATP).

Biosyntéza proteínu začína tým (v baktériách), že kodón AUG, ktorý sa nachádza na prvom mieste v kópii z každého génu, zaberá miesto na ribozóme v mieste darcu a t-RNA nesúca formylmetionín (ide o zmenený forma aminokyseliny metionín) je na ňu pripojená. Po dokončení syntézy proteínov sa formylmetionín odštiepi z polypeptidového reťazca.

Ribozóm má dve miesta na väzbu dvoch molekúl tRNA: darcu a akceptor. tRNA s aminokyselinou vstupuje do akceptorového miesta a pripája sa k jeho mRNA kodónu. Aminokyselina tejto t-RNA k sebe pripája rastúci proteínový reťazec a medzi nimi vzniká peptidová väzba. tRNA, ku ktorej je pripojený rastúci proteín, sa presúva spolu s kodónom mRNA na donorové miesto ribozómu. Na uvoľnené akceptorové miesto prichádza nová t-RNA s aminokyselinou a všetko sa znova opakuje. Keď sa na ribozóme objaví jedno z interpunkčných znamienok, žiadna z aminokyselinových tRNA nemôže obsadiť akceptorové miesto. Polypeptidový reťazec sa preruší a opustí ribozóm.

Bunky rôznych tkanív tela produkujú rôzne proteíny (amyláza - bunky slinných žliaz; inzulín - bunky pankreasu atď.). Z jedného oplodneného vajíčka zároveň vznikli všetky bunky tela opakovaným delením pomocou mitózy, t.j. majú rovnakú genetickú výbavu. Tieto rozdiely súvisia so skutočnosťou, že v rôznych bunkách sú transkribované rôzne oblasti DNA; vznikajú rôzne mRNA, podľa ktorých sa syntetizujú proteíny. Špecializáciu bunky neurčujú všetky gény, ale iba tie, z ktorých bola informácia načítaná a implementovaná do proteínov. V každej bunke sa teda realizuje len časť dedičnej informácie a nie všetky informácie ako celok.

Regulácia génovej aktivity pri syntéze jednotlivých proteínov na príklade baktérií (schéma F. Jacoba a Zh Monoda).

Je známe, že kým sa cukor nepridá do živného média, kde žijú baktérie, v bakteriálnej bunke nie sú žiadne enzýmy, ktoré sú potrebné na jej rozklad. Ale niekoľko sekúnd po pridaní cukru sa v bunke syntetizujú všetky potrebné enzýmy.

Enzýmy zapojené do rovnakého reťazca transformácie substrátu na konečný produkt sú kódované jeden po druhom štruktúrne gény jeden operón. Operon- Ide o skupinu génov, ktoré nesú informácie o štruktúre bielkovín potrebných na vykonávanie jednej funkcie. Medzi štruktúrnymi génmi a promótorom (pristávacie miesto pre RNA polymerázu) sa nachádza miesto tzv operátor. Nazýva sa tak preto, lebo z nej začína syntéza mRNA. Špeciálny proteín interaguje s operátorom - represor (supresor). Kým je represor na operátorovi, syntéza mRNA nemôže začať.

Keď sa do bunky dostane substrát, na ktorého štiepenie sú potrebné proteíny zakódované v štruktúrnych génoch daného operónu, jedna z molekúl substrátu interaguje s represorom. Represor stráca schopnosť interakcie s operátorom a vzďaľuje sa od neho; začína syntéza i-RNA a tvorba zodpovedajúcich proteínov na ribozóme. Len čo sa posledná molekula substrátu premení na konečnú látku, uvoľnený represor sa vráti k operátorovi a zablokuje syntézu mRNA.

Referencie:

1. Y. Chentsov "Úvod do bunkovej biológie" (2006)
2. V.N. Yarygin (editor) "Biológia" (v dvoch zväzkoch, 2006)
3. O.V. Alexandrovskaja a kol., "Cytológia, histológia a embryológia" (1987)
4. A.O. Ruvimsky (editor) "Všeobecná biológia" (učebnica pre ročníky 10-11 s hĺbkové štúdium biológia) - podľa mňa je to jedna z najlepších učebníc všeobecnej biológie pre uchádzačov, aj keď nie bezchybná.

Pre napredovanie histológie, cytológie a embryológie má veľký význam zavádzanie výdobytkov fyziky a chémie, nové metódy príbuzných vied - biochémia, molekulárna biológia, genetické inžinierstvo.

Moderné metódyštúdie umožňujú študovať tkanivá nielen ako celok, ale aj izolovať z nich jednotlivé typy buniek, aby mohli dlhodobo študovať ich životnú aktivitu, izolovať jednotlivé bunkové organely a ich makromolekuly (napríklad DNA) a študovať ich funkčné vlastnosti.

Takéto možnosti sa otvorili v súvislosti s vytvorením nových prístrojov a technológií - rôzne typy mikroskopov, počítačová technika, röntgenová difrakčná analýza, využitie nukleárnej magnetickej rezonancie (NMR), rádioaktívne izotopy a autorádiografia, elektroforéza a chromatografia, frakcionácia bunkového obsahu pomocou ultracentrifugácie, separácie a kultivácie buniek, získanie hybridov; využitie biotechnologických metód – získavanie hybridómov a monoklonálnych protilátok, rekombinantnej DNA a pod.

Biologické objekty je teda možné študovať na tkanivovej, bunkovej, subcelulárnej a molekulárnej úrovni. Napriek zavedeniu rôznych biochemických, biofyzikálnych, fyzikálnych a technologických metód do prírodných vied nevyhnutných na riešenie mnohých problémov súvisiacich s vitálnou aktivitou buniek a tkanív zostáva histológia v podstate morfologickou vedou s vlastným súborom metód. Tieto umožňujú charakterizovať procesy prebiehajúce v bunkách a tkanivách, ich štrukturálne vlastnosti.

Hlavnými fázami cytologickej a histologickej analýzy sú výber predmetu štúdie, jeho príprava na vyšetrenie pod mikroskopom, použitie mikroskopických metód a kvalitatívna a kvantitatívna analýza obrazov.

Predmetom štúdia sú živé a fixované bunky a tkanivá, ich obrazy získané vo svetelných a elektrónových mikroskopoch alebo na televíznej obrazovke. Existuje množstvo metód, ktoré umožňujú analýzu týchto objektov.

Metódy mikroskopie histologických preparátov

Hlavnými metódami štúdia biologických mikroobjektov sú svetelná a elektrónová mikroskopia, ktoré sú široko používané v experimentálnej a klinickej praxi.

Mikroskopia je hlavnou metódou štúdia mikroobjektov používaných v biológii už viac ako 300 rokov. Od vzniku a používania prvých mikroskopov sa neustále zdokonaľovali. Moderné mikroskopy sú rôzne zložité optické systémy s vysokým rozlíšením. Veľkosť najmenšej štruktúry, ktorú je možné vidieť pod mikroskopom, je určená najmenšou rozlíšiteľnou vzdialenosťou (d o ), ktorá závisí najmä od vlnovej dĺžky svetla. (\) a vlnové dĺžky elektromagnetických kmitov toku elektrónov atď. Táto závislosť je približne určená vzorcom d 0 = 1 / 2 \. Čím je teda vlnová dĺžka menšia, tým menšia je rozlíšiteľná vzdialenosť a tým menšie sú mikroštruktúry, ktoré možno v prípravku vidieť. Na štúdium histologických preparátov sa používajú rôzne typy svetelných mikroskopov a elektrónových mikroskopov.

Ryža. 1. Mikroskopy pre biologický výskum.

A - svetelný biologický mikroskop "Biolam-S": 1 - základňa; 2 - držiak rúrky; 3 - naklonená rúrka; 4 - okulár, 5 - revolver; 6 - šošovky; 7 - tabuľka; 8 - kondenzátor s irisovou clonou; 9 - skrutka kondenzátora; 10 - zrkadlo; 11 - mikrometrová skrutka; 12 - makrometrická skrutka. B - elektrónový mikroskop EMV-100AK s automatizovaným systémom spracovania obrazu: 1 - stĺpec mikroskopu (s elektrónovo-optickým systémom a kamerou na vzorky); 2 - ovládací panel; 3 - kamera s luminiscenčnou obrazovkou; 4 - blok analýzy obrazu; 5 - snímač video signálu.

Svetelná mikroskopia. Na štúdium histologických mikroobjektov sa používajú bežné svetelné mikroskopy a ich odrody, ktoré využívajú svetelné zdroje s rôznymi vlnovými dĺžkami. V konvenčných svetelných mikroskopoch je zdrojom osvetlenia prirodzené alebo umelé svetlo (obr. 1, A). Minimálna vlnová dĺžka viditeľnej časti spektra je približne 0,4 µm. Preto je pre bežný svetelný mikroskop najmenší vzdialenosť rozlíšenia je približne 0,2 µm ( d o = "/, - 0,4 μm = 0,2 μm) a celkové zväčšenie (súčin zväčšenia šošovky a zväčšenia okuláru) môže byť 1500-2500.

Vo svetelnom mikroskope tak možno vidieť nielen jednotlivé bunky s veľkosťou od 4 do 150 mikrónov, ale aj ich vnútrobunkové štruktúry – organely, inklúzie. Na zvýšenie kontrastu mikroobjektov sa používa ich farbenie.

ultrafialová mikroskopia. Ide o typ svetelnej mikroskopie. Ultrafialový mikroskop využíva kratšie ultrafialové lúče s vlnovou dĺžkou asi 0,2 µm. Rozlíšená vzdialenosť je tu 2-krát menšia ako v bežných svetelných mikroskopoch a je približne 0,1 μm (d o = V2 - 0,2 μm = 0,1 μm). Obraz získaný v ultrafialových lúčoch, okom neviditeľný, sa premení na viditeľný registráciou na fotografickej doske alebo pomocou špeciálnych zariadení (luminiscenčná obrazovka, elektrón-optický konvertor).

Fluorescenčná (luminiscenčná) mikroskopia. Fenomén fluorescencie spočíva v tom, že atómy a molekuly množstva látok pohlcujúcich krátkovlnné lúče prechádzajú do excitovaného stavu. Spätný prechod z excitovaného stavu do normálneho stavu nastáva pri emisii svetla, ale s dlhšou vlnovou dĺžkou. Vo fluorescenčnom mikroskope sa ako svetelné zdroje na excitáciu fluorescencie používajú ortuťové alebo ultravysokotlakové xenónové výbojky, ktoré majú vysoký jas v spektrálnej oblasti 0,25-0,4 μm (blízko ultrafialových lúčov) a 0,4-0,5 μm (modrofialové lúče). ). Vlnová dĺžka fluorescenčnej svetelnej vlny je vždy väčšia ako vlnová dĺžka excitačného svetla, preto sa oddeľujú pomocou svetelných filtrov a obraz objektu sa študuje iba vo svetle fluorescencie. Rozlišujte medzi vlastnou alebo primárnou a indukovanou alebo sekundárnou fluorescenciou. Každá bunka živého organizmu má svoju vlastnú fluorescenciu, ale často je extrémne slabá.

Serotonín, katecholamíny (adrenalín, noradrenalín) obsiahnuté v nervových, žírnych a iných bunkách majú primárnu fluorescenciu po fixácii tkaniva v parách formaldehydu pri 60-80 °C (Falkova metóda).

Sekundárna fluorescencia nastáva, keď sú prípravky ošetrené špeciálnymi farbivami - fluorochrómmi.

Existujú rôzne fluorochrómy, ktoré sa špecificky viažu na určité makromolekuly (akridínová oranž, rodamín, fluoresceín atď.). Napríklad pri spracovaní prípravkov sa najčastejšie používa fluorochróm akridínová oranž. V tomto prípade sú DNA a jej zlúčeniny v bunkách jasne zelené a RNA a jeho deriváty - jasne červená žiara. Spektrálne zloženie žiarenia teda nesie informáciu o vnútornej štruktúre objektu a jeho chemickom zložení. Variant metódy fluorescenčnej mikroskopie, pri ktorej dochádza k excitácii aj emisii fluorescencie v ultrafialovej oblasti spektra, sa nazýva metóda ultrafialová fluorescenčná mikroskopia.

Fázová kontrastná mikroskopia. Táto metóda sa používa na získanie vysoko kontrastných obrazov priehľadných a bezfarebných živých objektov, ktoré sú neviditeľné bežnými mikroskopickými metódami. Ako už bolo spomenuté, v bežnom svetelnom mikroskope sa potrebný kontrast štruktúr dosiahne farbením. Metóda fázového kontrastu poskytuje kontrast študovaných nefarbených štruktúr vďaka špeciálnej prstencovej membráne umiestnenej v kondenzore a takzvanej fázovej platni umiestnenej v objektíve. Táto konštrukcia optiky mikroskopu umožňuje previesť fázové zmeny svetla prechádzajúceho cez nezafarbený preparát, ktoré oko nevníma, na zmenu jeho amplitúdy, t.j. jas výsledného obrazu. Zvýšenie kontrastu vám umožní vidieť všetky štruktúry, ktoré sa líšia indexom lomu. Variantom metódy fázového kontrastu je metóda kontrast fázy a tmavého poľa, poskytnutie negatívneho oproti pozitívnemu fázovému kontrastnému obrazu.

Mikroskopia v tmavom poli. V mikroskope v tmavom poli sa k objektívu dostane len svetlo, ktoré ohýba štruktúry v preparáte. To sa deje v dôsledku prítomnosti špeciálneho kondenzátora v mikroskope, ktorý osvetľuje prípravok prísne šikmým svetlom; lúče z iluminátora smerujú zboku. Pole teda vyzerá tmavo a malé častice v prípravku odrážajú svetlo, ktoré potom vstupuje do šošovky. Rozlíšenie tohto mikroskopu nemôže byť lepšie ako rozlíšenie mikroskopu vo svetlom poli, pretože sa používa rovnaká vlnová dĺžka. Ale je tu väčší kontrast. Používa sa na štúdium živých objektov, autorádiografických objektov, ako sú strieborné zrná, ktoré sa v tmavom poli javia ako svetlé. Na klinike sa používa na štúdium kryštálov v moči (kyselina močová, oxaláty), na preukázanie spirochét, najmä treponema pallidum, ktorý spôsobuje syfilis atď.

interferenčnej mikroskopie. Druhy mikroskopu s fázovým kontrastom sú interferenčný mikroskop, ktorý je určený na kvantifikáciu hmoty tkaniva, a diferenciálny interferenčný mikroskop (s optikou Nomarsky), ktorý sa špecificky používa na štúdium povrchového reliéfu buniek a iných biologických objektov.

V interferenčnom mikroskope je lúč svetla z iluminátora rozdelený do dvoch prúdov: jeden prechádza objektom a mení fázu oscilácie, druhý prechádza obchádzaním objektu. V hranoloch objektívu sú oba lúče spojené a navzájom sa rušia. V dôsledku toho sa vytvorí obraz, v ktorom sa kontrastne líšia úseky mikroobjektu rôznej hrúbky a hustoty. Po kvantifikácii zmien stanovte koncentráciu a hmotnosť sušiny.

Mikroskopy s fázovým kontrastom a interferenčné mikroskopy umožňujú študovať živé bunky. Využívajú interferenčný efekt, ktorý nastáva, keď sa spoja dve sady vĺn na vytvorenie obrazu mikroštruktúr. Výhodou fázového kontrastu, interferencií a mikroskopie v tmavom poli je schopnosť pozorovať bunky v procese pohybu a mitózy. V tomto prípade je možné zaznamenať pohyb buniek pomocou časozberného mikrofilmovania (snímka po snímke).

polarizačná mikroskopia. Polarizačný mikroskop je modifikácia svetelného mikroskopu, v ktorej sú nainštalované dva polarizačné filtre - prvý (polarizačný) medzi svetelným lúčom a objektom a druhý (analyzátor) medzi šošovkou objektívu a okom. Svetlo prechádza cez prvý filter len jedným smerom, druhý filter má hlavnú os, ktorá je kolmá na prvý filter, a neprepúšťa svetlo. To vytvára efekt tmavého poľa. Oba filtre je možné otáčaním meniť smer svetelného lúča. Ak je analyzátor otočený o 90° vzhľadom na polarizátor, neprenikne cez ne žiadne svetlo. Štruktúry obsahujúce pozdĺžne orientované molekuly (kolagén, mikrotubuly, mikrofilamenty) a kryštalické štruktúry (v Leydigových článkoch 1) sa javia ako svietiace pri zmene osi rotácie. Schopnosť kryštálov alebo parakryštalických útvarov rozdeliť svetelnú vlnu na obyčajnú vlnu a na ňu kolmú vlnu sa nazýva dvojlom. Túto schopnosť majú fibrily priečne pruhovaných svalov.

Elektrónová mikroskopia. Veľkým krokom vpred vo vývoji mikroskopickej techniky bolo vytvorenie a využitie elektrónového mikroskopu (pozri obr. 1, B). Elektrónový mikroskop využíva prúd elektrónov s kratšími vlnovými dĺžkami ako svetelný mikroskop. Pri napätí 50 000 V je vlnová dĺžka elektromagnetických kmitov vznikajúcich pohybom prúdu elektrónov vo vákuu 0,0056 nm. Teoreticky sa vypočítalo, že rozlíšiteľná vzdialenosť za týchto podmienok môže byť približne 0,002 nm alebo 0,000002 um, t.j. 100 000 krát menej; než vo svetelnom mikroskope. V praxi je v moderných elektrónových mikroskopoch rozlíšiteľná vzdialenosť asi 0,1-0,7 nm.

V súčasnosti sú široko používané transmisné (transmisné) elektrónové mikroskopy (TEM) a skenovacie (skenovacie) elektrónové mikroskopy (SEM). Pomocou TEM možno získať len rovinný obraz skúmaného mikroobjektu. Na získanie priestorovej reprezentácie štruktúr sa používajú SEM, ktoré dokážu vytvoriť trojrozmerný obraz. Rastrovací elektrónový mikroskop pracuje na princípe skenovania skúmaného objektu elektrónovou mikrosondou, teda ostro zaostreným elektrónovým lúčom postupne „ohmatáva“ jednotlivé body povrchu. Na štúdium vybranej oblasti sa mikrosonda pohybuje po jej povrchu pôsobením vychyľovacích cievok (princíp televízneho skenovania). Takéto skúmanie objektu sa nazýva skenovanie (čítanie) a vzor, ​​po ktorom sa mikrosonda pohybuje, sa nazýva raster. Výsledný obraz sa zobrazí na televíznej obrazovke, ktorej elektrónový lúč sa pohybuje synchrónne s mikrosondou.

Hlavnými výhodami rastrovacej elektrónovej mikroskopie sú veľká hĺbka ostrosti, široký rozsah kontinuálnych zmien zväčšenia (od desiatok až po desaťtisíckrát) a vysoké rozlíšenie.

Mraziaca elektrónová mikroskopia- štiepkovanie používa sa na štúdium detailov štruktúry membrán a medzibunkových spojení. Bunky sa zmrazia pri nízkej teplote (-160 °C), aby sa vytvorili čipy. Pri skúmaní membrány prechádza rovina štiepenia stredom lipidovej dvojvrstvy. Ďalej vnútorné povrchy kovy (platina, paládium, urán) sa ukladajú na polovice membrán, študujú sa pomocou TEM a mikrofotografie.

Metóda kryoelektrónovej mikroskopie. Rýchlo zmrazená tenká vrstva (asi 100 nm) vzorky tkaniva sa umiestni na mikroskopickú mriežku a skúma sa pod mikroskopom vo vákuu pri -160 °C.

Metóda elektrónovej mikroskopie „zmrazenie- leptanie" Používa sa na štúdium vonkajšieho povrchu bunkových membrán. Po rýchlom zmrazení buniek pri veľmi nízkej teplote sa blok rozštiepi čepeľou noža. Výsledné ľadové kryštály sa odstránia sublimáciou vody vo vákuu. Potom sa oblasti buniek zatienia naprašovaním tenkého filmu ťažkého kovu (napríklad platiny). Metóda umožňuje odhaliť trojrozmernú organizáciu štruktúr.

Metódy zmrazenia-štiepenia a zmrazenia-leptania teda umožňujú študovať nefixované bunky bez toho, aby sa v nich vytvárali fixáciou indukované artefakty.

Metódy kontrastu so soľami ťažkých kovov umožňujú študovať jednotlivé makromolekuly - DNA, veľké proteíny (napríklad myozín) v elektrónovom mikroskope. Pri negatívnom kontraste sa študujú agregáty makromolekúl (ribozómy, vírusy) alebo proteínových filamentov (aktínové filamenty).

Elektrónová mikroskopia ultratenkých rezov získaných kryoultramikrotómiou. Pri tejto metóde sa kúsky tkaniva bez fixácie a zaliatia do pevných médií rýchlo ochladia v tekutom dusíku pri teplote -196 °C. To poskytuje inhibíciu metabolických procesov buniek a prechodu vody z kvapalnej fázy do pevnej. Ďalej sa bloky režú na ultramikrotóme pri nízkej teplote. Táto metóda delenia sa zvyčajne používa na stanovenie aktivity enzýmov, ako aj na vykonávanie imunochemických reakcií. Na detekciu antigénov sa používajú protilátky spojené s časticami koloidného zlata, ktorých lokalizáciu je možné na prípravkoch ľahko identifikovať.

Metódy ultravysokonapäťovej mikroskopie. Používajú sa elektrónové mikroskopy s urýchľovacím napätím do 3 000 000 V. Výhodou týchto mikroskopov je, že umožňujú študovať objekty veľkej hrúbky (1-10 mikrónov), keďže pri vysokej energii elektrónov sú objektom menej absorbované. Stereoskopické zobrazovanie umožňuje získať informácie o trojrozmernej organizácii intracelulárnych štruktúr s vysokým rozlíšením (asi 0,5 nm).

Röntgenová difrakčná analýza. Na štúdium štruktúry makromolekúl na atómovej úrovni sa používajú metódy využívajúce röntgenové žiarenie s vlnovou dĺžkou asi 0,1 nm (priemer atómu vodíka). Molekuly, ktoré tvoria kryštálovú mriežku, sa študujú pomocou difrakčných vzorov, ktoré sa zaznamenávajú na fotografickú platňu vo forme mnohých škvŕn rôznej intenzity. Intenzita škvŕn závisí od schopnosti rôznych objektov v poli rozptyľovať žiarenie. Poloha škvŕn v difrakčnom obrazci závisí od polohy objektu v systéme a ich intenzita udáva jeho vnútornú atómovú štruktúru.

Metódy štúdia fixných buniek a tkanív

Štúdium fixných buniek a tkanív. Hlavným predmetom výskumu sú histologické prípravky, vyrobené z pevných konštrukcií. Liekom môže byť náter (napríklad náter krvi, kostnej drene, slín, mozgovomiechového moku atď.), odtlačok (napríklad sleziny, týmusu, pečene), film tkaniva (napr. spojivové alebo peritoneálne, pleura, pia mater), tenký rez. Najčastejšie sa na štúdium používa časť tkaniva alebo orgánu. Histologické preparáty je možné študovať bez špeciálneho spracovania. Napríklad pripravený krvný náter, výtlačok, film alebo časť orgánu je možné okamžite vidieť pod mikroskopom. Ale vzhľadom na to, že štruktúry majú "slabý kontrast", sú v bežnom svetelnom mikroskope zle detekované a je potrebné použitie špeciálnych mikroskopov (fázový kontrast a pod.) Preto sa častejšie používajú špeciálne spracované prípravky.

Proces výroby histologického preparátu pre svetelnú a elektrónovú mikroskopiu zahŕňa tieto hlavné kroky: 1) odoberanie materiálu a jeho fixovanie, 2) zhutňovanie materiálu, 3) príprava rezov, 4) farbenie alebo kontrastné rezy. Pre svetelnú mikroskopiu je potrebný ešte jeden krok - uzatváranie rezov v balzame alebo inom transparentnom médiu (5). Fixácia zabezpečuje prevenciu rozkladných procesov, čo pomáha zachovať celistvosť štruktúr. Dosahuje sa to tak, že malá vzorka odobratá z orgánu sa buď ponorí do fixačného prostriedku (alkohol, formalín, roztoky solí ťažkých kovov, kyselina osmiová, špeciálne fixačné zmesi), alebo sa podrobí tepelnému spracovaniu. Pôsobením fixačného prostriedku dochádza v tkanivách a orgánoch k zložitým fyzikálno-chemickým zmenám. Najvýznamnejším z nich je proces ireverzibilnej koagulácie proteínov, v dôsledku čoho prestáva životne dôležitá aktivita a štruktúry sú mŕtve, fixované. Fixácia vedie k zhutneniu a zmenšeniu objemu kusov, ako aj k zlepšeniu následného farbenia buniek a tkanív.

tesniace kusy, potrebné na prípravu rezov, sa vyrába impregnáciou predtým dehydratovaného materiálu parafínom, celoidínom, organickými živicami. Rýchlejšie zhutnenie sa dosiahne použitím metódy zmrazenia kusov, napríklad v tekutej kyseline uhličitej.

Príprava sekcie vyrobené na špeciálnych zariadeniach - mikrotómy(pre svetelnú mikroskopiu) a ultramikrotómy(pre elektrónovú mikroskopiu).

Farbenie sekcií(vo svetelnej mikroskopii) príp ich postriekaním kovovými soľami(v elektrónovej mikroskopii) slúži na zvýšenie kontrastu obrazu jednotlivých štruktúr pri pohľade pod mikroskopom. Metódy farbenia histologických štruktúr sú veľmi rôznorodé a vyberajú sa v závislosti od cieľov štúdie. Histologické škvrny sa delia na kyslé, zásadité a neutrálne. Príklady zahŕňajú najznámejšie zásadité farbivo azúr II, ktoré farbí jadrá do fialova, a kyslé farbivo eozín, ktoré farbí cytoplazmu ružovo-oranžovo. Selektívna afinita štruktúr k určitým farbivám je spôsobená ich chemickým zložením a fyzikálnymi vlastnosťami. Štruktúry, ktoré sa dobre farbia kyslými farbivami, sa nazývajú oxyfilný(acidofilné, eozinofilné) a farbenie zásadité - bazofilné. Sú to štruktúry, ktoré prijímajú kyslé aj zásadité farbivá neutrofilné(heterofilné). Farebné prípravky sa zvyčajne dehydratujú v alkoholoch so zvyšujúcou sa silou a vyčistia sa v xyléne, benzéne, toluéne alebo niektorých olejoch. Pre dlhodobú konzerváciu sa dehydrovaný histologický rez vloží medzi sklíčko a krycie sklíčko do kanadského balzamu alebo iných látok. Hotový histologický preparát je možné používať na mikroskopické vyšetrenie dlhé roky. Pre elektrónovú mikroskopiu sa rezy získané na ultramikrotóme umiestnia na špeciálne mriežky, kontrastujú so soľami mangánu, kobaltu atď., Potom sa prezerajú pod mikroskopom a fotografujú. Získané mikrofotografie slúžia ako predmet štúdia spolu s histologickými preparátmi.

Metódy štúdia živých buniek a tkanív

Štúdium živých buniek a tkanív vám umožňuje získať najúplnejšie informácie o ich živote - sledovať pohyb, procesy delenia, ničenia, rastu, diferenciácie a interakcie buniek, trvanie ich životného cyklu, reaktívne zmeny v reakcii. na pôsobenie rôznych faktorov.

In vivo štúdie buniek v tele (vvivo). Jednou z dôležitých metód výskumu je pozorovanie štruktúr v živom organizme. Pomocou špeciálnych priesvitných mikroskopov-iluminátorov je napríklad možné študovať dynamiku krvného obehu v mikrocievach. Po anestézii zvieraťa sa predmet štúdie (napríklad mezentéria čreva) vyberie a vyšetrí pod mikroskopom, pričom tkanivá musia byť neustále zvlhčované izotonickým roztokom chloridu sodného. Trvanie takéhoto pozorovania je však obmedzené. Najlepšie výsledky sa dosiahnu implantáciou priehľadných komôr do tela zvieraťa.

Najvhodnejším orgánom na implantáciu takýchto kamier a následné pozorovanie je ucho zvieraťa (napríklad králika). Na stolík mikroskopu sa umiestni časť ucha s priehľadnou komorou a za týchto podmienok sa dlhodobo študuje dynamika zmien v bunkách a tkanivách. Tak možno študovať procesy vylučovania leukocytov z krvných ciev, rôzne štádiá tvorby spojivového tkaniva, kapilár, nervov a ďalšie procesy. Oko pokusných zvierat možno použiť ako prirodzenú priehľadnú kameru. Bunky, tkanivá alebo vzorky orgánov sa umiestnia do tekutiny prednej komory oka pod uhlom, ktorý tvorí rohovka a dúhovka a možno ich pozorovať cez priehľadnú rohovku. Týmto spôsobom sa transplantovalo oplodnené vajíčko a sledovali sa rané štádiá embryonálneho vývoja. Opiciam transplantovali malé kúsky maternice a študovali zmeny na sliznici maternice v rôznych fázach menštruačného cyklu.

Metóda transplantácie buniek krvi a kostnej drene zo zdravých darcovských zvierat príjemcom, ktorí boli vystavení letálnemu ožiareniu, našla široké uplatnenie. Príjemcovia zvierat po transplantácii zostali nažive v dôsledku prihojenia darcovské bunky ktoré tvoria kolónie hematopoetických buniek v slezine. Štúdium počtu kolónií a ich bunkového zloženia umožňuje identifikovať počet rodičovských hematopoetických buniek a rôzne štádiá ich diferenciácie. Pomocou metódy tvorby kolónií boli stanovené zdroje vývoja pre všetky krvinky.

Vitálne a supravitálne farbenie. Pri životnom (celoživotnom) farbení buniek a tkanív sa farbivo dostáva do tela živočícha, pričom selektívne farbí určité bunky, ich organely alebo medzibunkovú látku. Napríklad pomocou trypánovej modrej alebo lítiumkarmínu sa detegujú fagocyty a pomocou alizarínu, novovytvorenej kostnej matrice.

Supravitálne farbenie sa vzťahuje na farbenie živých buniek izolovaných z tela. Týmto spôsobom sa zisťujú mladé formy erytrocytov - krvné retikulocyty (brilantná kresylová modrá), mitochondrie v bunkách (farbivo Janusovo zelené), lyzozómy (neutrálne červené farbivo).

Štúdie živých buniek a tkanív v kultúre (vin vitro). Táto metóda je jednou z najbežnejších. Bunky izolované z ľudského alebo zvieracieho tela, malé vzorky tkanív alebo orgánov sa vkladajú do sklenených alebo plastových nádob obsahujúcich špeciálne živné médium - krvnú plazmu, embryonálny extrakt, ako aj umelé médiá. Existujú suspenzné kultúry (bunky suspendované v médiu), tkanivové, orgánové a jednovrstvové kultúry (explantované bunky tvoria súvislú vrstvu na skle). Je zabezpečená sterilita média a teplota zodpovedajúca telesnej teplote. Za týchto podmienok si bunky po dlhú dobu zachovávajú hlavné ukazovatele vitálnej aktivity - schopnosť rásť, rozmnožovať sa, diferencovať a pohybovať sa. Takéto kultúry môžu existovať mnoho dní, mesiacov a dokonca rokov, ak sa kultivačné médium obnoví a životaschopné bunky sa transplantujú do iných nádob. Niektoré typy buniek môžu v dôsledku zmien vo svojom genóme pretrvávať a množiť sa v kultúre, pričom vytvárajú súvislé bunkové línie. A. A. Maksimov, A. V. Rumyantsev, N. G. Khlopin, A. D. Timofeevsky a F. M. Lazarenko výrazne prispeli k rozvoju metód kultivácie buniek a tkanív. V súčasnosti boli získané bunkové línie fibroblastov, myocytov, epiteliocytov, makrofágov atď., ktoré existujú už mnoho rokov.

Použitie kultivačnej metódy umožnilo odhaliť množstvo vzorcov diferenciácie, malígnej transformácie buniek, bunkových interakcií, interakcií buniek s vírusmi a mikróbmi. Ukázala sa schopnosť buniek chrupavky vytvárať v kultúre medzibunkovú látku a schopnosť buniek nadobličiek produkovať hormóny. Kultivácia embryonálnych tkanív a orgánov umožnila sledovať vývoj kostí, kože a iných orgánov. Bola vyvinutá technika kultivácie nervových buniek.

Metóda tkanivových kultúr má osobitný význam pre uskutočňovanie experimentálnych pozorovaní na ľudských bunkách a tkanivách. Bunky odobraté z ľudského tela pri punkcii alebo biopsii sa môžu použiť v tkanivovej kultúre na určenie pohlavia, dedičných chorôb, malígnej degenerácie a na identifikáciu účinkov množstva toxických látok.

V posledných rokoch sa bunkové kultúry široko používajú na hybridizáciu buniek.

Boli vyvinuté metódy na separáciu tkanív do buniek, izoláciu jednotlivých typov buniek a ich kultiváciu.

Najprv sa tkanivo premení na bunkovú suspenziu zničením medzibunkových kontaktov a medzibunkovej matrice za pomoci proteolytických enzýmov (trypsín, kolagenáza) a zlúčenín viažucich Ca 2+ (pomocou EDTA - kyseliny etyléndiamíntetraoctovej). Výsledná suspenzia sa ďalej delí na frakcie buniek rôznych typov centrifugáciou, ktorá umožňuje oddelenie ťažších buniek od ľahších, veľkých od malých, alebo nalepením buniek na sklo alebo plast, ktorých schopnosť je pre rôzne typy rôzna. bunky. Na zabezpečenie špecifickej adhézie buniek k povrchu skla sa používajú protilátky, ktoré sa špecificky viažu na bunky rovnakého typu. Adherujúce bunky sa potom oddelia rozbitím matrice pomocou enzýmov, čím sa získa suspenzia homogénnych buniek. Jemnejším spôsobom separácie buniek je značenie protilátkami spojenými s fluorescenčnými farbivami. Označené bunky sa oddelia od neoznačených buniek pomocou triedičky (elektronický fluorescenčne aktivovaný bunkový analyzátor). Bunkový analyzátor triedi na 1 s približne 5000 bunkami. Izolované bunky možno študovať v kultivačných podmienkach.

Spôsob kultivácie buniek umožňuje študovať ich životnú aktivitu, reprodukciu, diferenciáciu, interakciu s inými bunkami, vplyv hormónov, rastových faktorov atď.

Kultúry sa zvyčajne pripravujú z bunkovej suspenzie pripravenej metódou tkanivovej disociácie opísanou vyššie. Väčšina buniek nie je schopná rásť v suspenzii, potrebujú pevný povrch, ktorým je povrch plastovej kultivačnej misky, niekedy so zložkami extracelulárnej matrice, ako je kolagén. Primárne plodiny sa nazývajú kultúry pripravené bezprostredne po prvej fáze bunkovej frakcionácie, sekundárne- bunkové kultúry transplantované z primárnych kultúr do nového média. Bunky môžu byť transplantované postupne počas týždňov a mesiacov, pričom bunky si zachovávajú svoje charakteristické znaky diferenciácie (napríklad epitelové bunky tvoria vrstvy). Východiskovým materiálom pre bunkové kultúry sú zvyčajne fetálne a neonatálne tkanivá.

Ako živné pôdy sa používajú zmesi solí, aminokyselín, vitamínov, konské sérum, extrakt z kuracieho embrya, embryonálne sérum atď.. Na kultiváciu rôznych typov buniek boli vyvinuté špeciálne médiá. Obsahujú jeden alebo viac proteínových rastových faktorov nevyhnutných na život a reprodukciu buniek. Napríklad nervový rastový faktor (NGF) je potrebný na rast nervových buniek.

Väčšina buniek v kultúre má určitý počet delení (50-100) a potom odumierajú. Niekedy sa v kultúre objavia mutantné bunky, ktoré sa donekonečna množia a tvoria bunkovú líniu (fibroblasty, epiteliocyty, myoblasty atď.). Mutantné bunky sa líšia od rakovinových buniek, ktoré sú tiež schopné nepretržitého delenia, ale môžu rásť bez toho, aby boli pripojené k pevnému povrchu. Rakovinové bunky v kultivačných miskách tvoria hustejšiu populáciu ako normálne bunkové populácie. Podobná vlastnosť môže byť indukovaná experimentálne v normálnych bunkách ich transformáciou vírusmi podobnými nádorom alebo chemickými zlúčeninami, čo vedie k vytvoreniu neoplasticky transformovaných bunkových línií. Bunkové línie netransformovaných a transformovaných buniek môžu byť dlhodobo skladované pri nízkych teplotách (-70 °C). Genetická homogenita buniek je posilnená klonovaním, kedy sa z jednej bunky pri jej postupnom delení získa veľká kolónia homogénnych buniek. Klon je populácia buniek odvodených z jednej progenitorovej bunky.

bunkové hybridy. Keď sa spoja dve bunky rôznych typov, vznikne heterokaryón – bunka s dvoma jadrami. Na získanie heterokaryónu sa bunková suspenzia ošetrí polyetylénglykolom alebo inaktivovanými vírusmi, aby sa poškodili bunkové plazmolémy, po čom sú bunky schopné fúzie. Napríklad neaktívne jadro kuracieho erytrocytu sa stane aktívnym (syntéza RNA, replikácia DNA), keď sa bunky spoja a prenesú do cytoplazmy inej bunky rastúcej v tkanivovej kultúre. Heterokaryón je schopný mitózy, výsledkom čoho je tvorba hybridná bunka. Plášte jadier heterokaryónu sú zničené a ich chromozómy sú spojené do jedného veľkého jadra.

Klonovanie hybridných buniek vedie k vytvoreniu hybridných bunkových línií, ktoré sa používajú na štúdium genómu. Napríklad v hybridnej bunkovej línii myši a človeka bola stanovená úloha ľudského chromozómu 11 pri syntéze inzulínu.

Hybridómy. Hybridómové bunkové línie sa používajú na získanie monoklonálnych protilátok. Protilátky sú produkované plazmatickými bunkami, ktoré vznikajú z B-lymfocytov počas imunizácie. Špecifický typ protilátky sa získa imunizáciou myší špecifickými antigénmi. Ak sú takéto imunizované lymfocyty klonované, možno získať veľké množstvo homogénnych protilátok. Životnosť B-lymfocytov v kultúre je však obmedzená. Preto sa spájajú s „nesmrteľnými“ nádorovými bunkami (B-lymfómy). V dôsledku toho sa vytvárajú hybridy. (hybridná bunka, s genómom z dvoch rôznych buniek; ohm - končiace na názvy nádorov). Takéto hybridómy sú schopné sa dlhodobo množiť v kultúre a syntetizovať protilátky určitého typu. Každý hybridómový klon je zdrojom monoklonálnych protilátok. Všetky molekuly protilátok daného druhu majú rovnakú antigén-väzbovú špecificitu. Je možné vytvoriť monoklonálne protilátky proti akémukoľvek proteínu obsiahnutému v bunke a použiť ich na lokalizáciu proteínov v bunke, ako aj na izoláciu proteínu zo zmesi (purifikácia proteínu), čo umožňuje študovať štruktúru a funkciu proteínov. . Monoklonálne protilátky sa tiež používajú v technológii klonovania génov.

Protilátky možno použiť na štúdium funkcie rôznych molekúl ich zavedením cez plazmalemu priamo do cytoplazmy buniek pomocou tenkej sklenenej pipety. Napríklad zavedenie protilátok proti myozínu do cytoplazmy oplodneného vajíčka morský ježko zastavuje delenie cytoplazmy.

Technológia rekombinantnej DNA. Klasické genetické metódy umožňujú študovať funkciu génov analýzou fenotypov mutantných organizmov a ich potomkov. Tieto metódy dopĺňa technológia rekombinantnej DNA, ktorá umožňuje podrobnú chemickú analýzu genetického materiálu a získanie veľkého množstva bunkových proteínov.

Hybridizačné metódy sú široko používané v modernej biológii na štúdium štruktúry génov a ich expresie.

Metódy štúdia chemického zloženia a metabolizmu buniek a tkanív

Na štúdium chemického zloženia biologických štruktúr - lokalizácie látok, ich koncentrácie a dynamiky v metabolických procesoch sa používajú špeciálne metódy výskumu.

Cyto- a histochemické metódy. Tieto metódy umožňujú odhaliť lokalizáciu rôznych chemikálií v štruktúrach buniek, tkanív a orgánov – DNA, RNA, bielkoviny, sacharidy, lipidy, aminokyseliny, minerály, vitamíny, aktivitu enzýmov. Tieto metódy sú založené na špecifickosti reakcie medzi chemickým činidlom a substrátom, ktorý je súčasťou bunkových a tkanivových štruktúr, a na farbení produktov chemickej reakcie. Na zvýšenie špecifickosti reakcie sa často používa enzymatická kontrola. Napríklad na detekciu ribonukleovej kyseliny (RNA) v bunkách sa často používa gallocyanín - farbivo so zásaditými vlastnosťami a prítomnosťou RNA potvrdené kontrolným ošetrením ribonukleázou, ktorá štiepi RNA. Gallocyanínové škvrny RNA v modro-fialovej farbe. Ak je rez vopred ošetrený ribonukleázou a potom zafarbený gallocyanínom, potom absencia farbenia potvrdzuje prítomnosť ribonukleovej kyseliny v štruktúre. Početné cyto- a histochemické metódy sú opísané v špecifických manuáloch.

Kombinácia histochemických metód s metódou elektrónovej mikroskopie viedla v posledných rokoch k rozvoju novej perspektívnej oblasti – elektrónovej histochémie. Táto metóda umožňuje študovať lokalizáciu rôznych chemikálií nielen na bunkovej, ale aj na subcelulárnej a molekulárnej úrovni.

Na štúdium bunkových makromolekúl sa využívajú veľmi citlivé metódy využívajúce rádioaktívne izotopy a protilátky, ktoré umožňujú detekovať aj malý obsah molekúl (menej ako 1000).

rádioaktívne izotopy pri rozpade jadra vyžarujú nabité častice (elektróny) alebo žiarenie (napríklad gama lúče), ktoré je možné zaregistrovať v špeciálnych prístrojoch. Rádioaktívne izotopy sa používajú v rádioautografii. Napríklad pomocou rádioizotopov 3H-tymidínu sa skúma jadrová DNA, pomocou 3H-uridínu - RNA.

rádioautografická metóda. Táto metóda umožňuje maximálne študovať metabolizmus v rôznych štruktúrach. Metóda je založená na použití rádioaktívnych prvkov (napríklad fosfor - 32 P, uhlík - 14 C, síra - 35 S, vodík - 3 H) alebo nimi značených zlúčenín. Rádioaktívne látky v histologických rezoch sa zisťujú pomocou fotografickej emulzie, ktorá sa nanesie na prípravok a následne vyvolá. V oblastiach liečiva, kde sa fotografická emulzia dostáva do kontaktu s rádioaktívnou látkou, dochádza k fotoreakcii, v dôsledku ktorej vznikajú osvetlené plochy (stopy). Touto metódou možno určiť napríklad rýchlosť inkorporácie značených aminokyselín do bielkovín, tvorbu nukleových kyselín, metabolizmus jódu v bunkách štítnej žľazy atď.

Metódy imunofluorescenčnej analýzy. Použitie protilátok. Protilátky sú ochranné proteíny produkované plazmatickými bunkami (deriváty B-lymfocytov) v reakcii na pôsobenie cudzorodých látok (antigénov). Počet rôznych foriem protilátok dosahuje milión. Každá protilátka má miesta na „rozpoznanie“ molekúl, ktoré spôsobili syntézu tejto protilátky. Vďaka vysokej špecificite protilátok na antigény je možné ich použiť na detekciu akýchkoľvek bunkových proteínov. Na identifikáciu lokalizácie proteínov sa protilátky zafarbia fluorescenčnými farbivami a potom sa bunky skúmajú pomocou fluorescenčnej mikroskopie. Protilátky možno použiť aj na štúdium antigénov na ultraštrukturálnej úrovni pomocou elektrónového mikroskopu. Na tento účel sú protilátky označené časticami s hustotou elektrónov (mikroguľôčky koloidného zlata). Na zvýšenie špecifickosti reakcie sa používajú monoklonálne protilátky, tvorené bunkovou líniou – klonmi získanými hybridómovou metódou z jednej bunky. Hybridómová metóda umožňuje získať monoklonálne protilátky s rovnakou špecifickosťou a v neobmedzenom množstve.

Metódy imunofluorescenčnej analýzy sú široko a efektívne používané v modernej histológii. Tieto metódy sa používajú na štúdium procesov diferenciácie buniek, na identifikáciu špecifických chemických zlúčenín a štruktúr v nich. Sú založené na reakciách antigén-protilátka. Každá bunka tela má špecifické antigénne zloženie, ktoré je určené najmä proteínmi. Reakčné produkty môžu byť zafarbené a detegované vo fluorescenčnom mikroskope, napríklad detekcia aktínu a tubulínu v bunke pomocou metódy imunofluorescenčnej analýzy (pozri kapitolu IV).

Moderné výskumné metódy umožňujú analyzovať chemické zloženie rôznych štruktúrnych zložiek buniek, fixných aj živých. Štúdium jednotlivých intracelulárnych štruktúr bolo možné po vývoji technológií frakcionácie bunkového obsahu.

Frakcionácia bunkového obsahu

Bunkové štruktúry a makromolekuly môžu byť frakcionované rôznymi metódami – ultracentrifugáciou, chromatografiou, elektroforézou. Tieto metódy sú podrobnejšie popísané v učebniciach biochémie.

Ultracentrifugácia. Pomocou tejto metódy možno bunky rozdeliť na organely a makromolekuly. Po prvé, bunky sú zničené osmotickým šokom, ultrazvukom alebo mechanickým pôsobením. V tomto prípade sa membrány (plazmolema, endoplazmatické retikulum) rozpadnú na fragmenty, z ktorých sa vytvoria najmenšie vezikuly a jadrá a organely (mitochondrie, Golgiho aparát, lyzozómy a peroxizómy) zostanú nedotknuté a sú vo formujúcej sa suspenzii.

Na oddelenie vyššie uvedených bunkových zložiek sa používa vysokorýchlostná centrifúga (80 000-150 000 ot./min.). Najprv sa väčšie časti (jadrá, cytoskelet) usadia (sediment) na dne skúmavky. S ďalším zvýšením rýchlosti odstreďovania frakcií supernatantu sa postupne usadzujú menšie častice - najskôr mitochondrie, lyzozómy a peroxizómy, potom mikrozómy a najmenšie vezikuly a nakoniec ribozómy a veľké makromolekuly. Počas odstreďovania sa rôzne frakcie usadzujú rôznymi rýchlosťami a vytvárajú v skúmavke oddelené pásy, ktoré je možné izolovať a skúmať. Frakcionované bunkové extrakty (bezbunkové systémy) sa široko používajú na štúdium vnútrobunkových procesov, napríklad na štúdium biosyntézy bielkovín, dešifrovanie genetického kódu atď.

Chromatografia sa široko používa na frakcionáciu proteínov.

Elektroforéza umožňuje oddeliť molekuly proteínov s rôznym nábojom umiestnením ich vodných roztokov (alebo do pevnej poréznej matrice) do elektrického poľa.

Metódy chromatografie a elektroforézy sa používajú na analýzu peptidov získaných štiepením molekuly proteínu a na získanie takzvaných peptidových máp proteínov. Tieto metódy sú podrobne popísané v učebniciach biochémie.

Štúdium chemického zloženia živých buniek. Na štúdium distribúcie látok a ich metabolizmu v živých bunkách sa využívajú techniky nukleárnej magnetickej rezonancie a mikroelektródy.

Nukleárna magnetická rezonancia (NMR) umožňuje študovať malé molekuly látok s nízkou molekulovou hmotnosťou. Vzorka tkaniva obsahuje atómy v rôznych molekulách a v rôznych prostrediach, takže bude absorbovať energiu pri rôznych rezonančných frekvenciách. Absorpčný diagram pri rezonančných frekvenciách pre danú vzorku bude jej spektrum NMR. V biológii je signál NMR z protónov (jadier vodíka) široko používaný na štúdium proteínov, nukleových kyselín atď. Na štúdium makromolekúl vo vnútri živej bunky sa často používajú izotopy 3H, 13 C, 35 K, 31 P na získanie NMR signál a sledovať jeho zmenu.v priebehu života bunky. Takže 3| P sa používa na štúdium svalovej kontrakcie - zmeny obsahu ATP a anorganického fosfátu v tkanivách. Izotop 13C umožňuje pomocou NMR študovať mnohé procesy, na ktorých sa podieľa glukóza. Použitie NMR je obmedzené jeho nízkou citlivosťou: 1 g živého tkaniva musí obsahovať aspoň 0,2 mm testovanej látky. Výhodou metódy je jej neškodnosť pre živé bunky.

Mikroelektródová technológia. Mikroelektródy sú sklenené trubičky naplnené elektricky vodivým roztokom (zvyčajne roztokom KC1 vo vode), ktorých koncový priemer sa meria v zlomkoch mikrónu. Hrot takejto skúmavky je možné zaviesť do cytoplazmy bunky cez plazmalemu a určiť koncentráciu iónov H +, Na +, K +, C1", Ca 2+, Mg 2+, potenciálny rozdiel na plazme membránou, a tiež vstrekujú molekuly do bunky.Na stanovenie koncentrácie konkrétneho iónu sa používajú iónovo selektívne elektródy, ktoré sú naplnené iónomeničovou živicou, ktorá je priepustná len pre tento ión.V posledných rokoch sa mikroelektródová technológia sa použila na štúdium transportu iónov cez špeciálne iónové kanály (špecializované proteínové kanály) v plazmatickej membráne. V tomto prípade mikroelektróda s hrubším hrotom, ktorý je tesne pritlačený k zodpovedajúcej časti plazmalemy. Táto metóda umožňuje na štúdium funkcie jedinej molekuly proteínu.Zmenu koncentrácie iónov vo vnútri bunky je možné určiť pomocou luminiscenčných indikátorov.Napríklad na štúdium intracelulárnej koncentrácie Ca 2+ sa používa luminiscenčný proteín akvarín (izolovaný z medúzy). , ktorý vyžaruje svetlo t v prítomnosti iónov Ca 2+ a reaguje na zmeny ich koncentrácie v rozsahu 0,5-10 μM. Boli tiež syntetizované fluorescenčné indikátory, ktoré sa silne viažu na Ca2+. Vytvorenie rôznych nových typov intracelulárnych indikátorov a moderné metódy analýzy obrazu umožňujú presne a rýchlo určiť intracelulárnu koncentráciu mnohých látok s nízkou molekulovou hmotnosťou.

Kvantitatívne metódy

V súčasnosti sú popri kvalitatívnych metódach vyvinuté a používané kvantitatívne histochemické metódy na stanovenie obsahu rôznych látok v bunkách a tkanivách. Znakom kvantitatívno-histochemických (na rozdiel od biochemických) metód výskumu je možnosť štúdia koncentrácie a obsahu chemických zložiek v špecifických bunkových a tkanivových štruktúrach.

Cytospektrofotometria- metóda kvantitatívneho štúdia vnútrobunkových látok ich absorpčnými spektrami.

Cytospektrofluorometria- metóda na kvantitatívne štúdium intracelulárnych látok ich fluorescenčnými spektrami alebo intenzitou fluorescencie pri jednej vopred zvolenej vlnovej dĺžke (cytofluorometria).

Moderné mikroskopy - cytofluorometre umožňujú detegovať malé množstvá látky v rôznych štruktúrach (do 10-14 -10-16 g) a odhadnúť lokalizáciu študovaných látok v mikroštruktúrach.

Metódy obrazovej analýzy bunkových a tkanivových štruktúr

Získané snímky mikroobjektov v mikroskope, na televíznej obrazovke, na elektrónových mikrofotografiách je možné podrobiť špeciálnej analýze - identifikácii morfometrických, denzitometrických parametrov a ich štatistickému spracovaniu.

Morfometrické metódy umožňujú určiť pomocou špeciálnych mriežok (E. Veibel, A. A. Glagolev, S. B. Stefanova) počet akýchkoľvek štruktúr, ich plochy, priemery a pod. Najmä v bunkách sú plochy jadier, cytoplazmy, ich priemery, jadrové- cytoplazmatické pomery atď. Existuje manuálna morfometria a automatizovaná morfometria, pri ktorej sa všetky parametre merajú a zaznamenávajú v prístroji automaticky.

V posledných rokoch sa čoraz viac rozširuje automatizácieintegrované systémy spracovania obrazu (ASOIS), umožňujúce čo najefektívnejšiu implementáciu vyššie uvedených kvantitatívnych metód na štúdium buniek a tkanív. Analytické možnosti kvantitatívnej mikroskopie sú zároveň doplnené metódami analýzy a rozpoznávania vzoriek založených na spracovaní informácií extrahovaných z obrazov buniek a tkanív pomocou elektronických počítačov (počítačov). V podstate môžeme hovoriť o zariadeniach, ktoré nielen zlepšujú optické možnosti ľudského vizuálneho analyzátora, ale tiež výrazne rozširujú jeho analytické možnosti. Vyjadruje sa názor, že ASOIz robí rovnakú revolúciu v morfológii, ku ktorej došlo asi pred 300 rokmi vďaka vynálezu svetelného mikroskopu a asi pred 50 rokmi - elektrónového mikroskopu, pretože nielenže nemerateľne zvyšujú produktivitu výskumníka a nielen objektivizujú pozorovania, ale umožňujú aj získavať nové informácie o dovtedy nedetekovateľných procesoch, numericky modelovať a predpovedať ich vývoj v bunkách a tkanivách.

Účasť na počítačovom experimente zároveň vyžaduje od výskumníka nový prístup k jeho implementácii, zručnosti pri zostavovaní algoritmov pre výskumný proces, presnosť uvažovania a v konečnom dôsledku zvýšenie vedeckej a metodologickej úrovne výskumu.

Jednou z metód, ktorá výrazne rozšírila počet riešených morfologických problémov, je opticko-štrukturálna strojová analýza (OSMA), navrhol v roku 1965 K. M. Bogdanov. V roku 1978 bola autorovi metódy udelená Štátna cena ZSSR. S príchodom OSMA sa urobil kvalitatívne nový krok vo vývoji jednotnej metodológie pre kvantitatívnu analýzu mikroštruktúr na základe štatistických charakteristík. Nedávno OSMA zistila efektívna aplikácia vo výskumnej praxi a národnom hospodárstve.

Na obr. 2 je znázornený automatizovaný systém spracovania obrazu Protva-MP vytvorený u nás spoločnosťou LOMO. Systém je určený na komplexné štúdium buniek a tkanív pomocou absorpčnej, fluorescenčnej mikroskopie a autorádiografie.

Špeciálny rastrovací optický alebo elektrónový mikroskop, ktorý je súčasťou systému, postupne zosníma obraz preparátu v dvoch súradniciach, prevedie ho do digitálnej podoby a vloží do počítača, ktorý následne obraz digitálne spracuje a poskytuje informácie o geometrických a iných charakteristikách analyzovaného objektu.

Pomocou farebného displeja môže výskumník obraz „rozrezať“, pričom zvýrazní len tie štrukturálne komponenty, ktoré ho zaujímajú. Priestranné zariadenia na ukladanie informácií, ktoré sú súčasťou počítača na magnetických diskoch alebo páskach, umožňujú ukladať ako samotné obrázky, tak aj výsledky ich spracovania na následné ukladanie a dokumentáciu.

Využitie metód na automatizovanú analýzu mikroobjektov zvážime na príklade spracovania obrazu krvného leukocytu (obr. 3) Skenovací mikroskop-fotometer umožňuje „prezerať“ hodnoty optickej hustoty riadok po riadku s krokom špecifikovaným výskumníkom Výsledkom je, že optický signál zodpovedajúci optickej hustote objektu sa prevedie do digitálnej formy Výsledná digitálna matrica sa pripravuje pomocou špeciálneho matematického prístroja

Najprv sa odstráni pozadie a izoluje sa „čistý“ objekt – obrázok bunky (1a), potom sa z obrázka bunky vyberie akýkoľvek detail, ktorý výskumníka zaujíma, napríklad cytoplazma (16) a jadra (radujem priemernú a integrálnu hodnotu optickej hustoty, disperzie, asymetrie, špičatosti a pod. Na základe obrazu objektu sa získajú morfometrické parametre: plocha, obvod, priemer, jadrovo-cytoplazmatický pomer, tvarový faktor a pod.

Ďalšou fázou spracovania obrazu je konštrukcia dvojrozmerných diagramov vzájomnej závislosti optickej hustoty pre celú bunku (pozri obr. 3), jej cytoplazmu (Wb) a jadro (Nm) a jadrá. Tieto diagramy umožňujú vypočítať parametre histogramu druhého rádu – homogenita, lokálny kontrast, entropia atď.

Ryža. 3. Automatizované spracovanie obrazu bunky (diagram).

Obrázok leukocytu (a), jeho cytoplazmy (b) a jadra (c). I - digitálny obraz; II - histogramy optickej hustoty; III - dvojrozmerné histogramy závislosti hodnôt optickej hustoty.

Takto získané parametre predstavujú viacrozmerný „portrét“ bunky a majú špecifické číselné vyjadrenie. Môžu byť podrobené rôznym metódam štatistického spracovania, umožňujú mimoriadne presnú klasifikáciu mikroobjektov, odhaľujú znaky ich štruktúry, ktoré nie sú vizuálne detekovateľné.

Hlavnými metódami cytologických štúdií sú svetelná a elektrónová mikroskopia, teda použitie svetelných a elektrónových mikroskopov, ktoré umožňujú vidieť vonkajšiu a vnútornú štruktúru buniek.

Svetelné mikroskopy umožňujú okrem iného pozorovať živé bunky (spravidla jednobunkové organizmy, slúžia na to krvinky). Rozlíšenie svetelných mikroskopov však nie je také vysoké ako u elektrónových mikroskopov. Rozlíšenie zväčšovacieho zariadenia je minimálna vzdialenosť medzi dvoma bodmi, ktoré je možné vidieť oddelene. Pre svetelné mikroskopy sa táto vzdialenosť meria v stovkách nanometrov a pre elektrónové mikroskopy v desiatkach a jednotkách nanometrov. Ak prvý používa svetelný tok (rozlíšenie je nepriamo úmerné vlnovej dĺžke), potom druhý používa tok elektrónov.

Existujú dva typy elektrónových mikroskopov – transmisné a skenovacie. Rozlíšenie prvého je o niečo vyššie, ale pomocou druhého možno získať trojrozmerný obraz. Pre transmisné mikroskopy sa pripravujú veľmi tenké rezy, cez ktoré prechádza elektrónový lúč. V skenovacích mikroskopoch sa elektrónový lúč odráža od objektu.

Používa sa aj v cytológii metóda fluorescenčnej mikroskopie, ktorá spočíva v tom, že do živých buniek sa pridávajú určité farbiace látky, ktoré po spojení s rôznymi zložkami bunky začnú žiariť. Vo svetelnom mikroskope teda možno pozorovať bunkové štruktúry (chloroplasty, mikrotubuly atď.).

Okrem mikroskopie sa v modernej cytológii využívajú aj iné metódy výskumu. Cytochemická metóda umožňuje študovať chemické zloženie bunky. Táto metóda je založená na chemické reakcie určité látky. Pridaním činidiel do buniek je možné v nich zistiť prítomnosť DNA, určitých proteínov atď., ako aj určiť ich množstvo.

Metóda rádiovej autografie zahŕňa zavedenie látky obsahujúcej označené (rádioaktívne) atómy. Po určitom čase sa značené molekuly začlenia do biopolymérov bunky a môžu sa použiť na sledovanie priebehu metabolických procesov v bunke.

Od 20-tych rokov XX storočia existuje taká metóda cytologického výskumu, ako je centrifugácia (alebo metóda frakcionácie bunkových štruktúr). Vychádza zo skutočnosti, že bunkové štruktúry majú rôznu hmotnosť a pri centrifugácii sa ukladajú rôznou rýchlosťou. Ak sú bunky zničené, potom sa po odstredení zmes rozdelí na frakcie, kde na dne budú ťažšie štruktúry (zvyčajne jadrá buniek) a na vrchu ľahšie.

Relatívne nový je metóda kultivácie buniek, ktorý umožňuje pestovať identické bunky (kolónie) z jednej alebo viacerých počiatočných buniek mimo tela za špeciálne vytvorených podmienok. Táto metóda umožňuje študovať vlastnosti jej buniek oddelene od tela, vykonávať cytologické, genetické a iné štúdie.

Nová metóda cytologického výskumu je mikrochirurgická metóda. Pomocou mikromanipulátora pripojeného k mikroskopu sa z buniek extrahujú alebo zavádzajú rôzne zložky, zavádzajú sa látky.

Murmanská štátna technická univerzita

Katedra biológie

Správa k téme:

"Výskumné metódy v cytológii"

Dokončené:

študent 1. ročníka

Technická fakulta

Katedry biológie

Serebryakova Lada Vjačeslavovna

Skontrolované:

Murmansk2001

Plán:

1. Čo študuje cytológia.

2. Predstava, že organizmy sa skladajú z buniek.

3. Metódy výskumu používané v cytológii.

4. Frakcionácia buniek.

5. Rádiová autografia.

6. Stanovenie dĺžky trvania niektorých štádií bunkového cyklu rádioautografiou.

Cytológia je veda o bunke. Z prostredia iných biologických vied vyčnieval takmer pred 100 rokmi. Po prvýkrát boli zovšeobecnené informácie o štruktúre buniek zozbierané v knihe J.-B. Carnoyova Biológia bunky, publikovaná v roku 1884. Moderná cytológia študuje štruktúru buniek, ich fungovanie ako elementárnych živých systémov: študuje sa funkcie jednotlivých bunkových zložiek, procesy reprodukcie buniek, ich opravy, adaptácia na podmienky prostredia a mnohé ďalšie procesy, ktoré umožňujú posúdiť vlastnosti a funkcie spoločné pre všetky bunky. Cytológia berie do úvahy aj štrukturálne znaky špecializovaných buniek. Inými slovami, moderná cytológia je fyziológia buniek. Cytológia je úzko spätá s vedeckými a metodologickými výdobytkami biochémie, biofyziky, molekulárnej biológie a genetiky. To poslúžilo ako základ pre hĺbkové štúdium bunky už z hľadiska týchto vied a pre vznik určitej syntetickej vedy o bunke - bunkovej biológie, alebo bunkovej biológie. V súčasnosti sa pojmy cytológia a bunková biológia zhodujú, keďže predmetom ich štúdia je bunka s vlastnými vzorcami organizácie a fungovania. Disciplína "Bunková biológia" sa vzťahuje na základné časti biológie, pretože skúma a popisuje jedinú jednotku všetkého života na Zemi - bunku.

Dlhé a podrobné štúdium bunky ako takej viedlo k formulácii dôležitého teoretického zovšeobecnenia všeobecného biologického významu, konkrétne k vzniku bunkovej teórie. V 17. storočí Robert Hooke, fyzik a biológ s veľkou vynaliezavosťou, vytvoril mikroskop. Pri skúmaní tenkého rezu korku pod mikroskopom Hooke zistil, že bol vyrobený z malých prázdnych buniek oddelených tenkými stenami, ktoré, ako už vieme, pozostávajú z celulóza. Tieto malé bunky nazval bunky. Neskôr, keď iní biológovia začali skúmať rastlinné tkanivá pod mikroskopom, ukázalo sa, že malé bunky, ktoré našiel Hooke v mŕtvom vysušenom korku, sa nachádzajú aj v živých rastlinných tkanivách, ale nie sú prázdne, ale každá obsahuje malé želatínové teliesko. . Po mikroskopickom skúmaní živočíšnych tkanív sa zistilo, že pozostávajú tiež z malých želatínových teliesok, ktoré sú však len zriedkavo oddelené stenami.V dôsledku všetkých týchto štúdií v roku 1939 Schleiden a Schwann nezávisle sformuloval bunkovú teóriu, ktorá tvrdí, že bunky sú elementárne jednotky, z ktorých sú v konečnom dôsledku postavené všetky rastliny a všetky živočíchy. Dvojitý význam slova bunka ešte nejaký čas spôsoboval nedorozumenia, no potom sa v týchto malých rôsolovitých telách pevne zakorenil.

Moderné znázornenie bunky úzko súvisí s technickým pokrokom a vylepšeniami výskumných metód. Okrem konvenčnej svetelnej mikroskopie, ktorá nestratila svoju úlohu, získala v posledných desaťročiach veľký význam polarizačná, ultrafialová, fluorescenčná a fázovo kontrastná mikroskopia. Medzi nimi osobitné miesto zaujíma elektrónová mikroskopia, ktorej rozlíšenie umožnilo preniknúť a študovať submikroskopickú a molekulárnu štruktúru bunky. Moderné metódy výskumu umožnili odhaliť detailný obraz bunkovej organizácie.

Každá bunka pozostáva z jadra a cytoplazmy, oddelených od seba a od vonkajšieho prostredia membránami. Zložky cytoplazmy sú: membrána, hyaloplazma, endoplazmatické retikulum a ribozómy, Golgiho aparát, lyzozómy, mitochondrie, inklúzie, bunkové centrum, špecializované organely.

Časť organizmu, ktorá vykonáva určitú funkciu, sa nazýva orgán. Každý orgán – napríklad pľúca, pečeň, obličky – má každý svoju špeciálnu štruktúru, vďaka ktorej hrá v tele určitú úlohu. Rovnakým spôsobom existujú v cytoplazme špeciálne štruktúry, ktorých zvláštna štruktúra im umožňuje vykonávať určité funkcie potrebné pre metabolizmus buniek; tieto štruktúry sa nazývajú organely ("malé orgány").

Objasnenie povahy, funkcie a distribúcie cytoplazmatických organel sa stalo možným až po rozvoji metód modernej bunkovej biológie. Najužitočnejšie v tomto smere boli: 1) elektrónová mikroskopia; 2) bunková frakcionácia, pomocou ktorej môžu biochemici izolovať relatívne čisté frakcie buniek obsahujúce určité organely, a tak študovať jednotlivé pre nich zaujímavé metabolické reakcie; 3) rádiová autografia, ktorá umožnila priame štúdium jednotlivých metabolických reakcií vyskytujúcich sa v organelách.

Metóda, ktorou sa izolujú organely z buniek, sa nazýva frakcionácia. Táto metóda sa ukázala ako veľmi plodná a dala biochemikom príležitosť izolovať rôzne bunkové organely v relatívne čistej forme. Umožňuje tiež určiť chemické zloženie organel a v nich obsiahnutých enzýmov a na základe získaných údajov vyvodiť závery o ich funkciách v bunke. Ako prvý krok sa bunky zničia homogenizáciou v nejakom vhodnom médiu, ktoré zachováva organely a bráni ich zhlukovaniu.Veľmi často sa na to používa roztok sacharózy. Hoci mitochondrie a mnohé ďalšie bunkové organely zostávajú nedotknuté, spleti membrán, ako je endoplazmatické retikulum a plazmatická membrána, sú fragmentované. Výsledné fragmenty membrány sa však často uzatvárajú do seba, výsledkom čoho sú zaoblené bubliny rôznych veľkostí.

V ďalšom štádiu sa bunkový homogenát podrobí sérii centrifugácií, ktorých rýchlosť a trvanie sa zakaždým zvýši; tento proces sa nazýva diferenciálna centrifugácia. Rôzne bunkové organely sa ukladajú na spodné centrifugačné skúmavky pri rôznych rýchlostiach centrifugácie v závislosti od veľkosti, hustoty a tvaru organel. Výsledná zrazenina sa môže odobrať a preskúmať. Veľké, husté štruktúry, ako sú jadrá, sa zrážajú najrýchlejšie, zatiaľ čo menšie, menej husté štruktúry, ako sú vezikuly endoplazmatického retikula, vyžadujú vyššiu rýchlosť a dlhší čas. Preto sa pri nízkych rýchlostiach odstreďovania jadrá usadzujú, zatiaľ čo ostatné bunkové organely zostávajú v suspenzii. Pri vyšších rýchlostiach sa zrážajú mitochondrie a lyzozómy a pri dlhom odstreďovaní a veľmi vysokých rýchlostiach sa vyzrážajú aj také malé častice, ako sú ribozómy. Precipitáty je možné skúmať pomocou elektrónového mikroskopu na stanovenie čistoty výsledných frakcií. Všetky frakcie sú do určitej miery kontaminované inými organelami. Ak je napriek tomu možné dosiahnuť dostatočnú čistotu frakcií, potom sa tieto podrobia biochemickej analýze, aby sa určilo chemické zloženie a enzymatická aktivita izolovaných organel.

Relatívne nedávno vznikla ďalšia metóda bunkovej frakcionácie - centrifugácia v hustotnom gradiente; súčasne prebieha odstreďovanie v skúmavke, v ktorej sa najprv na seba navrstvia roztoky sacharózy s neustále sa zvyšujúcou koncentráciou a následne aj s rastúcou hustotou. Počas odstreďovania sa organely obsiahnuté v homogenáte nachádzajú v centrifugačnej skúmavke na úrovniach, na ktorých sa nachádzajú roztoky sacharózy, čo zodpovedá ich hustote. Táto metóda dáva biochemikom možnosť separovať organely rovnakej veľkosti, ale rôznej hustoty (obr. 1.).

Autorádiografia je relatívne nová metóda, ktorá nesmierne rozšírila možnosti svetelnej aj elektrónovej mikroskopie. Ide o vysoko modernú metódu, vďaka rozvoju jadrovej fyziky, ktorá umožnila získať rádioaktívne izotopy rôznych prvkov. Pre rádioautografiu ide najmä o izotopy tých prvkov, ktoré bunka využíva alebo sa môžu viazať na látky používané bunkou, a ktoré možno podávať zvieratám alebo pridávať do kultúr v množstvách, ktoré nenarúšajú normálny bunkový metabolizmus. Keďže rádioaktívny izotop (alebo ním označená látka) sa zúčastňuje biochemických reakcií rovnako ako jeho nerádioaktívny náprotivok a zároveň emituje žiarenie, dráhu izotopov v organizme možno sledovať pomocou rôzne metódy detekcia rádioaktivity. Jeden spôsob detekcie rádioaktivity je založený na jej schopnosti pôsobiť na fotografický film ako svetlo; ale rádioaktívne žiarenie preniká čiernym papierom používaným na ochranu filmu pred svetlom a má na film rovnaký účinok ako svetlo.

Aby bolo možné detekovať žiarenie vyžarované rádioaktívnymi izotopmi na prípravkoch určených na štúdium pomocou svetelných alebo elektrónových mikroskopov, prikryjú sa prípravky v tmavej miestnosti špeciálnou fotografickou emulziou, po ktorej sa nechajú nejaký čas v tme. Potom sa prípravky vyvíjajú (aj v tme) a fixujú. Oblasti liečiva obsahujúce rádioaktívne izotopy ovplyvňujú emulziu ležiacu nad nimi, v ktorej sa pôsobením emitovaného žiarenia objavujú tmavé "zrnká". Dostávajú teda rádiové autogramy (gr. rádio- žiarivý autá- seba a grafo- písať).

Spočiatku mali histológovia len niekoľko rádioaktívnych izotopov; napríklad rádioaktívny fosfor bol použitý v mnohých raných štúdiách pomocou autorádiografie.Neskôr sa použilo oveľa viac týchto izotopov; Rádioaktívny izotop vodíka, trícium, našiel obzvlášť široké uplatnenie.

Rádiová autografia bola a stále je veľmi široko používaná na štúdium toho, kde a ako prebiehajú určité biochemické reakcie v tele.

Chemické zlúčeniny označené rádioaktívnymi izotopmi, ktoré sa používajú na štúdium biologických procesov, sa nazývajú prekurzory.Prekurzory sú zvyčajne látky podobné tým, ktoré telo prijíma z potravy; slúžia ako stavebné kamene pre stavbu tkanív a sú začlenené do komplexných komponentov buniek a tkanív rovnakým spôsobom, akým sa do nich začleňujú neoznačené stavebné bloky. Tkanivová zložka, do ktorej je začlenený označený prekurzor a ktorá emituje žiarenie, sa nazýva produkt.

Bunky pestované v kultúre, hoci sú rovnakého typu, budú v akomkoľvek danom čase v rôznych štádiách bunkového cyklu, pokiaľ sa neprijmú špeciálne opatrenia na synchronizáciu ich cyklov. Avšak vstreknutím trícium-tymidínu do buniek a následným autogramom je možné určiť trvanie rôznych štádií cyklu. Čas nástupu jedného štádia – mitózy – možno určiť bez značeného tymidínu. Za týmto účelom sa vzorka buniek z kultúry udržiava pod pozorovaním v mikroskope s fázovým kontrastom, ktorý umožňuje priamo sledovať priebeh mitózy a nastaviť jej načasovanie. Trvanie mitózy je zvyčajne 1 hodina, hoci v niektorých typoch buniek to trvá až 1,5 hodiny.

Definícia trvaniaG2-obdobie.

Na určenie trvania periódy G 2 sa používa metóda známa ako impulzný štítok: do bunkovej kultúry sa pridá značený tymidín a po krátkom čase sa kultivačné médium nahradí čerstvým, aby sa zabránilo ďalšej absorpcii značeného tymidínu bunkami. V tomto prípade je značka zahrnutá len v tých bunkách, ktoré sa počas krátkeho pobytu v médiu s trícium-tymidínom nachádzali v S-perióde bunkového cyklu. Podiel takýchto buniek je malý a len malá časť buniek dostane označenie. Okrem toho všetky bunky, ktoré obsahujú značku, budú v interfáze – od buniek, ktoré práve vstúpili do S-periódy, až po tie, ktoré ju takmer ukončili počas doby vystavenia trícium-tymidínu. Vo vzorke odobratej bezprostredne po odstránení označeného tymidínu je značka obsiahnutá len v medzifázových jadrách patriacich bunkám, ktoré boli v S-perióde počas periódy expozície označenia; rovnaké bunky, ktoré boli počas tohto obdobia v stave mitózy, zostávajú neoznačené.

Ak potom budete pokračovať v odoberaní vzoriek z kultúry v určitých intervaloch a vytvárate rádiový autogram pre každú nasledujúcu vzorku, potom príde moment, keď sa štítok začne objavovať mitotickýd- chromozómy. Označenia budú zahrnuté vo všetkých tých bunkách, ktoré boli v S-perióde počas prítomnosti trícium-tymidínu v médiu, a medzi týmito bunkami budú bunky, ktoré práve vstúpili do S-periódy, ako aj tie, ktoré ju takmer ukončili. . Je celkom zrejmé, že tieto bunky budú prvé medzi označenými bunkami, ktoré podstúpia mitózu, a následne sa značka nájde v ich mitotických chromozómoch. Interval medzi 1) časom, keď bol značený tymidín odstránený z kultúry, a 2) časom objavenia sa značených mitotických chromozómov bude teda zodpovedať trvaniu periódy G2 bunkového cyklu.

Definícia trvaniaS- obdobie.

Pretože bunky, ktoré sú na samom konci S-periódy v momente zavedenia značky do média, budú prvé, ktoré vstúpia do mitózy, následne v tých bunkách, v ktorých S-perióda začína bezprostredne pred značkou sa odstránia označené mitotické chromozómy ako posledné. Preto, ak by sme mohli určiť interval medzi vstupom do mitózy buniek označených ako prvý a buniek označených ako posledné, stanovili by sme trvanie S-periódy. Hoci je ľahké určiť čas, kedy sa označené mitotické chromozómy prvýkrát objavia, čas vstupu do mitózy buniek označených ako posledný sa nedá určiť (bráni tomu veľmi veľký počet označených deliacich sa buniek v posledných vzorkách). Trvanie S-periódy sa preto musí určiť iným spôsobom.

Pri štúdiu rádioautogramov po sebe nasledujúcich vzoriek buniek odoberaných v pravidelných intervaloch sa zistilo, že podiel buniek nesúcich značku vo svojich mitotických chromozómoch sa postupne zvyšuje, až kým nie sú označené doslova všetky deliace sa bunky. Keď však bunky dokončia mitózu jedna po druhej, stanú sa označenými medzifázovými bunkami. Ako prvé dokončia mitózu tie označené bunky, ktoré do nej vstúpili ako prvé; a podľa toho z buniek so značenými mitotickými chromozómami ako posledné dokončili mitózu tie, ktoré do nej vstúpili ako posledné. Keďže trvanie mitózy je vždy rovnaké, ak by sme teda mohli určiť interval medzi: 1) časom ukončenia mitózy v bunkách, ktoré boli označené ako prvé, a 2) časom ukončenia mitózy. mitózy v bunkách, ktoré sa na znamienko obrátili ako posledné, by sme stanovili trvanie periódy S. Periódu nie je ťažké určiť určením intervalu medzi: 1) momentom, kedy 50 % mitotických buniek v kultúre sú označené a 2) čas, po ktorom kultúra už neobsahuje 50 % označených buniek.

Stanovenie generačného času (celkové trvanie celého bunkového cyklu).

Pokračovaním v odoberaní vzoriek buniek z kultúry možno zistiť, že označené mitotické útvary v určitom bode úplne zmiznú a potom sa znova objavia. Takéto deliace sa bunky sú dcérske bunky odvodené od tých materských buniek, ktoré obsahovali značku, pričom sa nachádzali v S-perióde v čase expozície trícium-tymidínu. Tieto materské bunky prešli do S-periódy, rozdelili sa a potom prešli druhou interfázou a druhým delením, to znamená, že prešli jedným úplným cyklom a časťou ďalšieho. Čas potrebný na dokončenie úplného bunkového cyklu sa nazýva čas. generácie. Zodpovedá intervalu medzi dvoma po sebe nasledujúcimi vrcholmi inklúzie značky a zvyčajne zodpovedá segmentu medzi tými bodmi postupných vzostupných kriviek, v ktorých 50 % mitotických útvarov obsahuje značku.

Literatúra.

A. Ham, D. Kormak "Histológia", zväzok 1 Moskva "MIR" 1982;

M.G.Abramov "Klinická cytológia" Moskva "MEDICÍNA" 1974;

Yu.S. Chentsov "Všeobecná cytológia"