Koja metoda se koristi u citologiji. Citologija - nauka o ćeliji Savremene metode istraživanja. Ćelijski nivo organizacije života

Osnove citologije

Cell. Ćelijska teorija.

Cell- najmanja struktura sposobna za samoreprodukciju. Pojam "ćelija" uveo je R. Hooke 1665. godine (proučavao je mikroskopom rezove starije stabljike - jezgro i čep; iako sam Hooke nije vidio ćelije, već njihove ljuske). Poboljšanje mikroskopske tehnologije omogućilo je otkrivanje raznolikosti oblika ćelija, složenosti strukture jezgra, procesa stanične diobe itd. Mikroskop je poboljšao Antony van Leeuwenhoek (njegovi mikroskopi su dali povećanje od 270- 300 puta).

Druge metode istraživanja ćelija:

1. diferencijalno centrifugiranje- na osnovu činjenice da različite ćelijske strukture imaju različite gustine. Uz vrlo brzu rotaciju u uređaju (ultracentrifuga), organele fino mljevenih stanica talože se iz otopine, raspoređene u slojeve u skladu sa svojom gustinom. Ovi slojevi se odvajaju i proučavaju.
2. elektronska mikroskopija- koristi se od 30-ih godina 20. vijeka (kada je izumljen elektronski mikroskop - daje povećanje i do 10 6 puta); pomoću ove metode proučavaju strukturu najmanjih struktura ćelije, uklj. pojedinačne organele i membrane.
3. autoradiografija- metoda koja vam omogućava da analizirate lokalizaciju tvari označenih radioaktivnim izotopima u stanicama. Tako se otkrivaju mjesta sinteze tvari, sastav proteina i načini unutarćelijskog transporta.
4. fazno kontrastna mikroskopija- koristi se za proučavanje prozirnih bezbojnih objekata (živih ćelija). Prilikom prolaska kroz takav medij, svjetlosni valovi se pomjeraju za količinu koja je određena debljinom materijala i brzinom svjetlosti koja prolazi kroz njega. Mikroskop faznog kontrasta pretvara ove pomake u crno-bijelu sliku.
5. analiza difrakcije rendgenskih zraka- proučavanje ćelije uz pomoć rendgenskih zraka.

Godine 1838-1839. botaničar Matthias Schleiden i fiziolog Theodor Schwann stvorili ćelijska teorija. Njegova suština je bila da je glavni strukturni element svih živih organizama (biljki i životinja) ćelija.

1. ćelija - elementarna živi sistem; osnova građe, života, razmnožavanja i individualnog razvoja organizama.
2. ćelije različitih tjelesnih tkiva i ćelije svih organizama slične su po strukturi i hemijskom sastavu.
3. nove ćelije nastaju samo dijeljenjem već postojećih ćelija.
4. rast i razvoj bilo kojeg višećelijskog organizma posljedica je rasta i reprodukcije jedne ili više početnih stanica.

Molekularni sastav ćelije.

Zovu se kemijski elementi koji čine ćelije i obavljaju bilo koju funkciju biogeni. Prema sadržaju elemenata koji čine ćeliju, dijele se u tri grupe:

1. makronutrijenti- čine većinu ćelije - 99%. Od toga, 98% otpada na 4 elementa: C, O, H i N. U ovu grupu spadaju i K, Mg, Ca, P, C1, S, Na, Fe.
2. elementi u tragovima- to uglavnom uključuje jone koji su dio enzima, hormona i drugih tvari. Njihova koncentracija je od 0,001 do 0,000001% (B, Cu, Zn. Br, I, Mo, itd.).
3. ultramikroelementi- njihova koncentracija ne prelazi 10 -6%, a fiziološka uloga nije otkrivena (Au, Ag, U, Ra).

Hemijske komponente živih bića se dijele na neorganski(voda, mineralne soli) i organski(proteini, ugljikohidrati, lipidi, nukleinske kiseline, vitamini).

Voda. Uz nekoliko izuzetaka (koštana i zubna caklina), voda je dominantna komponenta ćelija – u prosjeku 75-85%. U ćeliji je voda u slobodnom i vezanom stanju. Molekul vode je dipol- na jednom kraju je negativan naboj, na drugom - pozitivan, ali općenito je molekul električno neutralan. Voda ima veliki toplotni kapacitet i relativno visoku toplotnu provodljivost za tečnosti.

Biološki značaj vode: univerzalni rastvarač (za polarne supstance, nepolarne supstance se ne rastvaraju u vodi); okruženje za reakcije, učesnik u reakcijama (razgradnji proteina), učestvuje u održavanju termičke ravnoteže ćelije; izvor kiseonika i vodonika tokom fotosinteze; glavno sredstvo za transport materija u telu.

Joni i soli. Soli su dio kostiju, školjki, školjki itd., tj. obavljaju potporne i zaštitne funkcije, a također učestvuju u metabolizmu minerala. Joni su dio različitih supstanci (gvožđe – hemoglobin, hlor – hlorovodonična kiselina u želucu, magnezijum – hlorofil) i učestvuju u regulatornim i drugim procesima, kao i u održavanju homeostaze.

Vjeverice. Po sadržaju u ćeliji zauzimaju prvo mjesto među organska materija. Proteini su nepravilni polimeri sastavljeni od aminokiselina. Proteini se sastoje od 20 različitih aminokiselina. Amino kiseline:

NH2-CH-COOH | R

Povezivanje aminokiselina odvija se na sljedeći način: amino grupa jedne kiseline se spaja s karboksilnom grupom druge i oslobađa se molekul vode. Rezultirajuća veza se zove peptid(neka vrsta kovalentnog), a samo jedinjenje - peptid. Jedinjenje mnogih aminokiselina naziva se polipeptid. Ako se protein sastoji samo od aminokiselina, onda se naziva jednostavnim ( proteina), ako uključuje druge supstance, onda složene ( proteid).

Prostorna organizacija proteina uključuje 4 strukture:

1. Primarno(linearni) - polipeptidni lanac, tj. niz aminokiselina povezanih kovalentnim vezama.
2. Sekundarni- proteinska nit je uvijena u spiralu. Stvara vodonične veze.
3. tercijarni- spirala se dalje namotava, formirajući globulu (kalem) ili fibril (izdužena struktura). U njemu nastaju hidrofobne i elektrostatičke interakcije, kao i kovalentne disulfidne -S-S- veze.
4. kvartar- povezivanje više proteinskih makromolekula zajedno.

Razgradnja strukture proteina se naziva denaturacija. Može biti nepovratan (ako je oštećena primarna struktura) ili reverzibilan (ako su oštećene druge strukture).

Funkcije proteina:

1. enzimi su biološki aktivne supstance, katalizuju hemijske reakcije. Poznato je više od 2000 enzima. Svojstva enzima: specifičnost djelovanja (svaki djeluje samo na određenu tvar - supstrat), aktivnost samo u određenoj sredini (svaki enzim ima svoj optimalni pH raspon) i na određenoj temperaturi (kako temperatura raste, vjerovatnoća denaturacije povećava, pa se smanjuje aktivnost enzima), veća efikasnost djelovanja uz malo sadržaja. Bilo koji enzim ima aktivni centar- ovo je posebno mjesto u strukturi enzima za koje je vezan molekul supstrata. Trenutno, na osnovu strukture, enzimi su podijeljeni u dvije glavne grupe: potpuno proteinski enzimi i enzimi koji se sastoje od dva dijela: apoenzim (proteinski dio) i koenzim (neproteinski dio; ovo je ion ili molekul koji se vezuje za proteinski dio , formirajući katalitički aktivan kompleks). Koenzimi su joni metala, vitamini. Bez koenzima, apoenzim ne funkcioniše.
2. regulatorni - hormoni.
3. transport - hemoglobin.
4. zaštitni - imunoglobulini (antitijela).
5. pokret - aktin, miozin.
6. zgrada (strukturna).
7. energije - izuzetno rijetko, tek nakon što pređu ugljikohidrati i lipidi.

Ugljikohidrati- organske supstance, koje uključuju C, O i H. Opšta formula: C n (H 2 O) n, gde je n najmanje 3. Dijele se u 3 klase: monosaharidi, disaharidi (oligosaharidi) i polisaharidi.

Monosaharidi(jednostavni ugljikohidrati) - sastoje se od jedne molekule, to su čvrste kristalne tvari, vrlo topljive u vodi, slatkog okusa. Riboza I deoksiriboza(C 5) - dio su DNK i RNK. Glukoza(C 6 H 12 O 6) - je dio polisaharida; glavni primarni izvor energije u ćeliji. Fruktoza I galaktoza izomera glukoze.

Oligosaharidi- sastoje se od 2, 3 ili 4 monosaharidna ostatka. Najvažnije disaharidi- sastoje se od 2 ostatka; dobro rastvorljiv u vodi, slatkog ukusa. saharoza(C 12 H 22 O 11) - sastoji se od ostataka glukoze i fruktoze; široko rasprostranjen u biljkama. laktoza (mliječni šećer)- sastoji se od glukoze i galaktoze. Najvažniji izvor energije za mlade sisare. Maltoza- sastoji se od 2 molekula glukoze. Glavni je strukturni element škroba i glikogena.

Polisaharidi- makromolekularne supstance koje se sastoje od velikog broja monosaharidnih ostataka. Slabo rastvorljiv u vodi, nema sladak ukus. Škrob- Predstavljaju ga dva oblika: amiloza (sastoji se od ostataka glukoze povezanih u nerazgranati lanac) i amilopektin (sastoji se od ostataka glukoze, linearnih i razgranatih lanaca). Glikogen- polisaharid životinja i gljiva. Struktura podsjeća na škrob, ali je više razgranata. Vlakna (celuloza)- glavni strukturni polisaharid biljaka, dio je ćelijskih zidova. To je linearni polimer.

Funkcije ugljenih hidrata:

1. energija - 1 g sa potpunim raspadom daje 17,6 kJ.
2. Strukturalni.
3. Podrška (u biljkama).
4. Opskrba hranjivim tvarima (skrob i glikogen).
5. Zaštitno - viskozne tajne (sluz) bogate su ugljikohidratima i štite zidove šupljih organa.

Lipidi- kombinuju masti i supstance slične mastima - lipoidi. Masti su estri masnih kiselina i glicerola. Masne kiseline: palmitinska, stearinska (zasićena), oleinska (nezasićena). Biljne masti su bogate nezasićenim kiselinama, pa su topljive, tečne na sobnoj temperaturi. Životinjske masti sadrže uglavnom zasićene kiseline, pa su vatrostalnije, na sobnoj temperaturi - čvrste. Sve masti su nerastvorljive u vodi, ali su lako rastvorljive u nepolarnim rastvaračima; loše provode toplotu. Masti su fosfolipidi(ovo je glavna komponenta ćelijskih membrana) - sadrže ostatak fosforne kiseline. Lipoidi uključuju steroide, voskove itd.

Funkcije lipida:

1. strukturalni
2. energija - 1 g sa potpunim raspadom daje 38,9 kJ.
3. Skladištenje nutrijenata (masno tkivo)
4. Termoregulacija (potkožna masnoća)
5. Dobavljači endogene vode - kada se oksidira 100 g masti, oslobađa se 107 ml vode (princip kamile)
6. Zaštita unutrašnjih organa od oštećenja
7. Hormoni (estrogeni, androgeni, steroidni hormoni)
8. Prostaglandini su regulatorne supstance koje održavaju tonus vaskularnih i glatkih mišića i učestvuju u imunološkim odgovorima.

ATP (adenozin trifosfat). Energija koja se oslobađa pri razgradnji organskih supstanci ne koristi se odmah za rad u ćelijama, već se prvo pohranjuje u obliku visokoenergetskog jedinjenja – ATP. ATP se sastoji od tri ostatka fosforne kiseline, riboze (monosaharida) i adenina (ostatka dušične baze). Kada se jedan ostatak fosforne kiseline odcijepi, nastaje ADP, a ako se odcijepe dva ostatka, onda nastaje AMP. Reakcija cijepanja svakog ostatka je praćena oslobađanjem 419 kJ/mol. Ova veza fosfor-kiseonik u ATP-u se zove makroergijski. ATP ima dvije makroergijske veze. ATP se formira u mitohondrijima iz AMP, koji prvo vezuje jedan, zatim drugi ostatak fosforne kiseline uz apsorpciju 419 kJ/mol energije (ili iz ADP-a uz dodatak jednog ostatka fosforne kiseline).

Primjeri energetski intenzivnih procesa: biosinteza proteina.

Nukleinske kiseline- To su visokomolekularna organska jedinjenja koja obezbeđuju skladištenje i prenos naslednih informacija. Prvi put opisao Švajcarac Friedrich Miescher u 19. stoljeću (1869.). Postoje dvije vrste nukleinskih kiselina.

DNK (deoksiribonukleinska kiselina)

Sadržaj u kavezu je striktno konstantan. Uglavnom se nalazi u jezgru (gdje formira hromozome koji se sastoje od DNK i dvije vrste proteina). DNK je nepravilan biopolimer čiji je monomer nukleotid koji se sastoji od azotne baze, ostatka fosforne kiseline i monosaharida deoksiriboze. Postoje 4 vrste nukleotida u DNK: A (adenin), T (timin), G (gvanin) i C (citozin). A i G su purinske baze, C i T su pirimidinske baze. Istovremeno, u DNK je broj purinskih baza jednak broju pirimidinskih baza, kao i A = T i C = G (Chargaffovo pravilo).

Godine 1953. J. Watson i F. Crick su otkrili da je molekul DNK dvostruka spirala. Svaka spirala se sastoji od polinukleotidnog lanca; lanci su upleteni jedan oko drugog i zajedno oko zajedničke ose, svaki zavoj spirale sadrži 10 pari nukleotida. Lanci se drže zajedno vodoničnim vezama koje nastaju između baza (između A i T - dvije, između C i G - tri veze). Polinukleotidni lanci su komplementarni jedan drugom: suprotno adeninu u jednom lancu uvijek se nalazi timin u drugom i obrnuto (A-T i T-A); suprotno citozinu - guaninu (C-G i G-C). Ovaj princip strukture DNK naziva se princip komplementarnosti ili komplementarnosti.

Svaki lanac DNK ima specifičnu orijentaciju. Dva lanca u molekulu DNK nalaze se u suprotnom smjeru, tj. antiparalelno.

Glavna funkcija DNK je skladištenje i prijenos nasljednih informacija.

RNA (ribonukleinska kiselina)

1. i-RNA (messenger RNA) - sadržana je u jezgru i citoplazmi. Njegova funkcija je prijenos informacija o strukturi proteina od DNK do mjesta sinteze proteina.
2. t-RNA (transferna RNA) - uglavnom u citoplazmi ćelije. Funkcija: transport molekula aminokiselina do mjesta sinteze proteina. Ovo je najmanja RNK.
3. r-RNA (ribosomalna RNA) - učestvuje u formiranju ribozoma. Ovo je najveća RNK.

Struktura ćelije.

Glavne komponente ćelije su: vanjska ćelijska membrana, citoplazma i jezgro.

Membrane. U sastavu biološke membrane ( plazmalema) uključuje lipide koji čine osnovu membrane i proteine ​​visoke molekularne težine. Molekuli lipida su polarni i sastoje se od polarnih hidrofilnih glava koje nose naboj i nepolarnih hidrofobnih repova (masnih kiselina). Membrana sadrži uglavnom fosfolipidi(u svom sastavu imaju ostatke fosforne kiseline). Membranski proteini mogu biti površno, integralni(prožimaju membranu kroz) i poluintegralni(uronjeni u membranu).

Savremeni model biološke membrane tzv "Univerzalni model fluidnog mozaika", prema kojem su globularni proteini uronjeni u dvostruki lipidni sloj, dok neki proteini kroz njega prodiru, drugi djelimično. Smatra se da su integralni proteini amfifilni, njihove nepolarne regije su uronjene u lipidni dvosloj, a polarne strše prema van, formirajući hidrofilnu površinu.

Submembranski ćelijski sistem (submembranski kompleks). To je specijalizirani periferni dio citoplazme i zauzima granični položaj između radnog metaboličkog aparata ćelije i plazma membrane. U submembranskom sistemu površinskog aparata mogu se razlikovati dva dela: periferni hijaloplazma, gde su koncentrisani enzimski sistemi povezani sa procesima transmembranskog transporta i recepcije, i strukturno mišićno-koštanog sistema. Mišićno-skeletni sistem se sastoji od mikrofibrila, mikrotubula i skeletnih fibrilnih struktura.

Supramembranske strukture eukariotske ćelije mogu se podijeliti u dvije široke kategorije.

1. Pravi supramembranski kompleks, ili glikokaliks 10-20 nm debljine. Sastoji se od proteina periferne membrane, ugljikohidratnih dijelova glikolipida i glikoproteina. Glikokaliks igra važnu ulogu u funkciji receptora, obezbeđuje "individualizaciju" ćelije - sadrži receptore za kompatibilnost tkiva.
2. Derivati ​​supramembranskih struktura. To uključuje specifične hemijske spojeve koje sama ćelija ne proizvodi. Najbolje ih je proučavati na mikrovilima epitelnih stanica crijeva sisara. Ovdje su hidrolitički enzimi adsorbirani iz crijevne šupljine. Njihov prijelaz iz suspendiranog u fiksno stanje stvara osnovu za kvalitativno drugačiji tip probave, takozvanu parijetalnu probavu. Potonji, u svojoj suštini, zauzima srednji položaj između šupljine i intracelularnog.

Funkcije biološke membrane:

1. barijera;
2. receptor;
3. interakcija ćelija;
4. održavanje oblika ćelije;
5. enzimska aktivnost;
6. transport supstanci u ćeliju i van nje.

Membranski transport:

1. za mikromolekule. Razlikovati aktivni i pasivni transport.

   TO pasivno uključuju osmozu, difuziju, filtraciju. Difuzija- transport tvari prema nižoj koncentraciji. Osmoza- kretanje vode prema rastvoru veće koncentracije. Uz pomoć pasivnog transporta, kreću se vode i tvari topljive u mastima.

   TO aktivan transport uključuje: prijenos tvari uz učešće enzima nosača i jonskih pumpi. Enzim nosač vezuje prenesenu supstancu i "vuče" je u ćeliju. Na primjeru rada razmatran je mehanizam jonske pumpe kalijum-natrijum pumpa: tokom njegovog rada, tri Na+ se prenose iz ćelije za svaka dva K+ u ćeliju. Pumpa radi na principu otvaranja i zatvaranja kanala i po svojoj hemijskoj prirodi je protein-enzim (razgrađuje ATP). Protein se veže za jone natrijuma, mijenja svoj oblik, a unutar njega se formira kanal za prolaz natrijevih jona. Nakon prolaska kroz ove jone, protein ponovo menja oblik i otvara se kanal kroz koji prolaze joni kalijuma. Svi procesi su energetski zavisni.

   Osnovna razlika između aktivnog transporta i pasivnog transporta je u tome što dolazi sa troškovima energije, dok pasivni transport nije.

2. za makromolekule. Javlja se uz pomoć aktivnog hvatanja supstanci od strane ćelijske membrane: fagocitoze i pinocitoze. Fagocitoza- hvatanje i apsorpcija velikih čestica od strane ćelije (na primjer, uništavanje patogenih mikroorganizama od strane makrofaga ljudskog tijela). Prvi put opisao I.I. Mechnikov. pinocitoza- proces hvatanja i apsorpcije kapljica tekućine u ćeliji sa tvarima otopljenim u njoj. Oba procesa odvijaju se po sličnom principu: na površini ćelije tvar je okružena membranom u obliku vakuole, koja se kreće prema unutra. Oba procesa su povezana sa potrošnjom energije.

Citoplazma. U citoplazmi se razlikuju glavna tvar (hijaloplazma, matriks), organele (organele) i inkluzije.

Osnovna supstanca ispunjava prostor između plazmaleme, nuklearne membrane i drugih intracelularnih struktura. Formira unutrašnje okruženje ćelije, koje ujedinjuje sve unutarćelijske strukture i osigurava njihovu međusobnu interakciju. Citoplazma se ponaša kao koloid sposoban da pređe iz gela u sol i obrnuto. Sol- ovo je stanje materije koje karakteriše niska viskoznost i bez poprečnih veza između mikrofilamenata. Gel- ovo je stanje materije koje karakteriše visok viskozitet i prisustvo veza između mikrofilamenata. Vanjski sloj citoplazme, ili ektoplazma, ima veću gustoću i lišen je granula. Primjeri procesa koji se odvijaju u matriksu: glikoliza, razgradnja tvari do monomera.

Organelles- strukture citoplazme koje obavljaju specifične funkcije u ćeliji.

Organele su:

1. membranski (jedno- i dvomembranski (mitohondriji i plastidi)) i nemembranski.
2. organele opšteg značaja i posebne. Prvi uključuju: ER, Golgijev aparat, mitohondrije, ribozome i polisome, lizozome, ćelijski centar, mikrotijela, mikrotubule, mikrofilamente. Organele posebne namjene (prisutne u stanicama koje obavljaju specijalizirane funkcije): cilije i flagele (pokret ćelije), mikroresice, sinaptičke vezikule, miofibrile.

Ćelijske inkluzije- to su nestalne formacije, koje nastaju ili nestaju u procesu života ćelije, tj. su proizvodi ćelijskog metabolizma. Najčešće se nalaze u citoplazmi, rjeđe u organelama ili u jezgru. Inkluzije su uglavnom predstavljene granulama (polisaharidi: glikogen kod životinja, škrob u biljkama; rjeđe proteini - u citoplazmi jaja), kapi (lipidi) i kristali (kalcij oksalat). U ćelijske inkluzije spadaju i neki pigmenti - žuti i smeđi lipofuscin (akumulira se tokom starenja ćelije), retinin (deo vizuelnog pigmenta), hemoglobin, melanin itd.

Core. Glavna funkcija nukleusa je skladištenje nasljednih informacija. Komponente jezgra su nuklearna membrana, nukleoplazma (nuklearni sok), nukleolus (jedna ili dvije), nakupine hromatina (hromozomi). Nuklearna membrana eukariotske stanice odvaja nasljedni materijal (hromozome) od citoplazme, u kojoj se odvijaju različite metaboličke reakcije. Nuklearni omotač se sastoji od 2 biološke membrane. U određenim intervalima, obje membrane se spajaju jedna s drugom, formirajući pore su rupe u nuklearnoj membrani. Preko njih se odvija metabolizam sa citoplazmom.

osnovu nukleoplazmačine proteini, uključujući i fibrilarne. Sadrži enzime neophodne za sintezu nukleinskih kiselina i ribozoma. Nuklearni sok takođe sadrži RNK.

Nukleoli- ovo je mjesto sastavljanja ribozoma, to su nestalne strukture jezgra. Oni nestaju na početku diobe ćelije i ponovo se pojavljuju pred njezin kraj. U nukleolu se razlikuju amorfni dio i nukleolarni filament. Obje komponente su građene od filamenata i granula, koje se sastoje od proteina i RNK.

hromozomi. Hromozomi se sastoje od DNK okružene sa dve vrste proteina: histon(glavni) i nonhistone(kiselo). Kromosomi mogu biti u dva strukturna i funkcionalna stanja: spiralizirano I despiralizovano. Djelomično ili potpuno dekondenzirano (despiralizirano) stanje naziva se radno stanje, jer u ovom stanju se dešavaju procesi transkripcije i reduplikacije. Neaktivno stanje - u stanju metaboličkog mirovanja pri njihovoj maksimalnoj kondenzaciji, kada obavljaju funkciju distribucije i prenosa genetskog materijala u ćelije kćeri.

IN međufaza Hromozomi su predstavljeni kuglom tankih niti, koje se mogu razlikovati samo pod elektronskim mikroskopom. Prilikom diobe hromozomi se skraćuju i zgušnjavaju, spiraliziraju se i jasno su vidljivi pod mikroskopom (najbolje u fazi metafaze). U ovom trenutku, hromozomi se sastoje od dvije hromatide povezane primarnom konstrikcijom, koja dijeli svaku hromatidu na dva dijela - ramena.

Prema lokaciji primarne konstrikcije razlikuje se nekoliko tipova hromozoma:

1. metacentrično ili jednaki krakovi (oba kraka hromozoma imaju istu dužinu);
2. submetacentričan ili nejednake ruke (krake hromozoma se donekle razlikuju po veličini);
3. akrocentrično(jedna ruka je vrlo kratka).

ćelijski metabolizam.

Ovo je jedno od osnovnih svojstava živih bića. Metabolizam je moguć zbog činjenice da su živi organizmi otvoreni sistemi, tj. Između organizma i okoline postoji stalna razmjena materije i energije. Metabolizam se odvija u svim organima, tkivima i ćelijama, obezbeđujući samoobnavljanje morfoloških struktura i hemijskog sastava citoplazme.

Metabolizam se sastoji od dva procesa: asimilacije (ili plastične razmjene) i disimilacije (ili razmjene energije). Asimilacija(plastična razmjena) - ukupnost svih procesa biosinteze koji se odvijaju u živim organizmima. Disimilacija(energetski metabolizam) - ukupnost svih procesa razgradnje složenih supstanci u jednostavne uz oslobađanje energije, koji se odvijaju u živim organizmima.

Prema načinu asimilacije i ovisno o vrsti utrošene energije i polaznim materijalima organizmi se dijele na autotrofe (fotosintetičari i hemosintetici) i heterotrofe. Autotrofi- To su organizmi koji samostalno sintetiziraju organske tvari, koristeći za to energiju Sunca ( fotoautotrofi) ili energija oksidacije anorganskih supstanci ( hemoautotrofi). Autotrofi uključuju biljke, bakterije, plavo-zelene. Heterotrofi- To su organizmi koji uz hranu dobijaju gotove organske materije. To uključuje životinje, gljive, bakterije.

Uloga autotrofa u kruženju supstanci je ogromna: 1) transformišu energiju Sunca u energiju hemijskih veza organskih supstanci, koju koriste sva druga živa bića na našoj planeti; 2) zasićiti atmosferu kiseonikom (fotoautotrofi), koji je neophodan većini heterotrofa za dobijanje energije oksidacijom organskih materija. Heterotrofi također igraju važnu ulogu u ciklusu tvari: oslobađaju neorganske tvari (ugljični dioksid i vodu) koje koriste autotrofi.

Disimilacija. Svi heterotrofni organizmi dobijaju energiju kao rezultat redoks reakcija, tj. one u kojima se elektroni prenose sa donora-reduktora elektrona na akceptore elektrona - oksidatore.

Razmjena energije aerobni organizmi sastoji se od tri faze:

1. pripremni, koji prolazi u gastrointestinalnom traktu ili u ćeliji pod djelovanjem enzima lizosoma. Tokom ove faze, svi biopolimeri se razlažu do monomera: proteini se prvo razlažu na peptide, zatim na aminokiseline; masti - do glicerola i masnih kiselina; ugljikohidrati - do monosaharida (do glukoze i njenih izomera).
2. anoksičan(ili anaerobni), koji se odvija u matriksu citoplazme. Ova faza se zove glikoliza. Pod dejstvom enzima, glukoza se razlaže na dva PVC molekula. U tom slučaju se oslobađaju 4 H atoma, koje prihvata supstanca koja se zove NAD + (nikotinamid adenin dinukleotid). Istovremeno, NAD + se vraća u NAD * H (ova pohranjena energija će se kasnije koristiti za sintezu ATP-a). Također, zbog razgradnje glukoze, iz ADP-a nastaju 4 ATP molekula. Istovremeno se tokom hemijskih reakcija glikolize troše 2 molekula ATP-a, tako da je ukupan prinos ATP-a nakon glikolize 2 molekula ATP-a.
3. kiseonik koji se odvija u mitohondrijima. Dva molekula PVC-a ulaze u enzimski prstenasti "transporter", koji se naziva Krebsov ciklus ili ciklus trikarboksilne kiseline. Svi enzimi ovog ciklusa nalaze se u mitohondrijima.

Jednom u mitohondrijima, PVC se oksidira i pretvara u supstancu bogatu energijom - acetil koenzim A(derivat je sirćetne kiseline). Nadalje, ova tvar reagira s Pikeom, stvarajući limunsku kiselinu (citrat), koenzim A, protone (prihvaćene od strane NAD +, koji se pretvara u NAD * H) i ugljični dioksid. Nakon toga, limunska kiselina se oksidira i ponovo se pretvara u PEA, koji reagira s novom molekulom acetil koenzima A, i cijeli ciklus se ponavlja iznova. Tokom ovog procesa, energija se pohranjuje u obliku ATP-a i NAD*H.

Sljedeća faza je pretvaranje energije pohranjene u NAD * H u energiju ATP veza. Tokom ovog procesa, elektroni iz NAD*H kreću se duž višestepenog lanca transporta elektrona do konačnog akceptora, molekularnog kiseonika. Kada se elektroni kreću od koraka do koraka, oslobađa se energija koja se koristi za pretvaranje ADP-a u ATP. Budući da je u ovom procesu oksidacija povezana s fosforilacijom, cijeli proces se naziva oksidativna fosforilacija(Ovaj proces je otkrio ruski naučnik V.A. Engelhardt; javlja se na unutrašnjoj membrani mitohondrija). Na kraju ovog procesa nastaje voda. Tokom faze kiseonika, formira se 36 ATP molekula.

Dakle, krajnji proizvodi razgradnje glukoze su ugljični dioksid i voda. Potpunom razgradnjom jedne molekule glukoze oslobađa se 38 ATP molekula. S nedostatkom kisika u ćeliji, glukoza se oksidira stvaranjem mliječne kiseline (na primjer, kod intenzivnog rada mišića - trčanja itd.). Kao rezultat, formiraju se samo dva ATP molekula.

Treba napomenuti da ne samo molekuli glukoze mogu poslužiti kao izvor energije. Masne kiseline se također oksidiraju u ćeliji do acetil koenzima A, koji ulazi u Krebsov ciklus; u isto vrijeme, NAD + se obnavlja u NAD * H, koji je uključen u oksidativnu fosforilaciju. Uz akutni nedostatak glukoze i masnih kiselina u ćeliji, mnoge aminokiseline podliježu oksidaciji. Oni također formiraju acetil koenzim A ili organske kiseline uključene u Krebsov ciklus.

At metoda anaerobne disimilacije nema faze kiseonika, a energetski metabolizam u anaerobima naziva se "fermentacija". Krajnji produkti disimilacije tokom fermentacije su mliječna kiselina (bakterije mliječne kiseline) ili etilni alkohol (kvasac). Kod ovog tipa metabolizma, 2 molekula ATP-a se oslobađaju iz jedne molekule glukoze.

Dakle, aerobno disanje je skoro 20 puta energetski korisnije od anaerobnog disanja.

fotosinteza.Život na Zemlji u potpunosti ovisi o fotosintezi biljaka, koja opskrbljuje organske tvari i O 2 sve organizme. Fotosinteza pretvara svjetlosnu energiju u energiju kemijske veze.

fotosinteza- to je stvaranje organskih tvari iz neorganskih uz sudjelovanje sunčeve energije. Ovaj proces je otkrio K.A. Timirjazev u 19. veku. Ukupna jednadžba fotosinteze: 6CO 2 + 6H 2 O \u003d C 6 H 12 O 6 + 6O 2.

Fotosinteza se odvija u biljkama koje imaju plastide - hloroplasti. Kloroplasti imaju dvije membrane, iznutra - matriks. Imaju dobro razvijenu unutrašnju membranu, koja ima nabore, između kojih se nalaze mjehurići - tilakoidi. Neki od tilakoida su naslagani u grupe tzv zrna. Granas sadrži sve fotosintetske strukture; u stromi koja okružuje tilakoide nalaze se enzimi koji redukuju ugljični dioksid u glukozu. Glavni pigment hloroplasta je hlorofil, po strukturi sličan ljudskom hemu. Klorofil sadrži atom magnezija. Klorofil apsorbira plave i crvene zrake spektra i odbija zelene. Mogu biti prisutni i drugi pigmenti: žuti karotenoidi i crveni ili plavi fikobilini. Karotenoidi su maskirani hlorofilom; apsorbiraju svjetlost koja nije dostupna drugim pigmentima i prenose je na hlorofil.

Hloroplasti sadrže dva fotosistema različite strukture i sastava: fotosistem I i II. Fotosistem I ima reakcioni centar, koji je molekul hlorofila u kompleksu sa specifičnim proteinom. Ovaj kompleks apsorbuje svetlost talasne dužine od 700 nm (zbog čega se naziva fotohemijski centar P700). Fotosistem II takođe ima reakcioni centar, fotohemijski centar P680.

Fotosinteza ima dvije faze: svijetli i tamni.

svjetlosna pozornica. Energiju svjetlosti apsorbira hlorofil i dovodi je u pobuđeno stanje. Elektron u fotohemijskom centru P700 apsorbira svjetlost, prelazi na viši energetski nivo i prenosi se na NADP + (nikotinamid adenin dinukleotid fosfat), redukujući ga u NADP*H. U molekulu hlorofila fotosistema I ostaju “rupe” – nepopunjena mjesta za elektrone. Ove "rupe" su ispunjene elektronima koji dolaze iz fotosistema II. Pod djelovanjem svjetlosti, elektron klorofila u fotohemijskom centru P680 također ulazi u pobuđeno stanje i počinje se kretati duž lanca nosača elektrona. Na kraju, ovaj elektron dolazi u fotosistem I, popunjavajući slobodna mjesta u njemu. U tom slučaju elektron gubi dio energije koja se troši na stvaranje ATP-a iz ADP-a.

Takođe u hloroplastima, pod dejstvom sunčeve svetlosti, voda se cepa - fotoliza, pri čemu nastaju elektroni (ulaze u fotosistem II i zauzimaju mjesto elektrona koji su otišli u lanac nosača), protoni (NADP+ se prihvataju) i kisik (kao nusprodukt):

2H 2 O \u003d 4H + + 4e - + O 2

Tako se kao rezultat svjetlosnog stadijuma akumulira energija u obliku ATP-a i NADP*H, kao i stvaranje kisika.

mračna faza. Ne zahtijeva svjetlo. Molekul ugljen-dioksida reaguje sa 1,5 ribuloza difosfatom (ovo je derivat riboze) uz pomoć enzima. Nastaje intermedijerni spoj C 6, koji se razlaže vodom na dva molekula fosfoglicerinske kiseline (C 3). Od ovih supstanci se složenim reakcijama sintetiše fruktoza koja se potom pretvara u glukozu. Ove reakcije zahtijevaju 18 ATP molekula i 12 NADP*H molekula. Biljke proizvode škrob i celulozu iz glukoze. Fiksacija CO 2 i njegovo pretvaranje u ugljikohidrate je ciklično i naziva se Calvinov ciklus.

Važnost fotosinteze za Poljoprivreda veliki - prinos useva zavisi od toga. U fotosintezi biljka koristi samo 1-2% sunčeve energije, tako da postoji velika perspektiva povećanja prinosa kroz odabir sorti sa većom fotosintetskom efikasnošću. Za povećanje efikasnosti fotosinteze koriste se: veštačko osvetljenje (dodatno osvetljenje fluorescentnim lampama u oblačnim danima ili u proleće i jesen) u plastenicima; nedostatak zasjenjenja kultiviranih biljaka, poštivanje potrebnih udaljenosti između biljaka itd.

Hemosinteza. To je proces stvaranja organskih tvari iz anorganskih tvari korištenjem energije dobivene oksidacijom neorganskih tvari. Ova energija se skladišti u obliku ATP-a. Hemosintezu je otkrio ruski mikrobiolog S.N. Vinogradskog u 19. stoljeću (1889-1890). Ovaj proces je moguć kod bakterija: sumpornih bakterija (oksidiraju sumporovodik do sumpora, pa čak i do sumporne kiseline); nitrificirajuće bakterije (oksidiraju amonijak u dušičnu kiselinu).

DNK replikacija(udvostručavanje DNK). Kao rezultat ovog procesa formiraju se dvije dvostruke spirale DNK, koje se ne razlikuju od originalne (majčinske). Prvo, uz pomoć posebnog enzima (helikaze), dvostruka spirala DNK se odmotava na mjestima porijekla replikacije. Zatim, uz učešće enzima DNK polimeraze, dolazi do sinteze ćerki DNK lanaca. Na jednom od lanaca proces se nastavlja kontinuirano - ovaj lanac se naziva vodeći. Drugi lanac DNK se sintetizira u kratkim fragmentima ( fragmenti Okazakija), koji se "spajaju" uz pomoć posebnih enzima. Ovaj lanac se zove zaostajanje ili zaostajanje.

Područje između dvije tačke gdje počinje sinteza kćeri lanaca naziva se replicon. Eukarioti imaju mnogo replikona u svojoj DNK, dok prokarioti imaju samo jedan replikon. U svakom replikonu možete vidjeti viljuška za replikaciju- onaj dio molekule DNK koji se već razotkrio.

Replikacija se zasniva na nekoliko principa:

1. komplementarnost (A-T, C-G) antiparalelizam. Svaki lanac DNK ima specifičnu orijentaciju: jedan kraj nosi OH grupu vezanu za ugljik od 3" u šećernoj dezoksiribozi, na drugom kraju lanca nalazi se ostatak fosforne kiseline na poziciji 5" šećera. Dva lanca DNK su orijentirana u suprotnim smjerovima, tj. antiparalelno. Enzim DNK polimeraza može se kretati duž lanaca šablona u samo jednom smjeru: od njihovih 3' krajeva do 5' krajeva. Stoga, u procesu replikacije, simultana sinteza novih lanaca teče antiparalelno.
2. polukonzervativan. Formiraju se dvije ćerke spirale, od kojih svaka čuva (sačuva) jednu od polovica majčinske DNK nepromijenjene
3. diskontinuitet. Da bi se formirali novi lanci DNK, roditeljski lanci moraju biti potpuno raspleteni i rastegnuti, što je nemoguće; stoga replikacija počinje istovremeno na nekoliko mjesta.

biosinteza proteina. Primjer plastičnog metabolizma u heterotrofnim organizmima je biosinteza proteina. Svi glavni procesi u organizmu povezani su sa proteinima, a u svakoj ćeliji postoji stalna sinteza proteina karakterističnih za ovu ćeliju i neophodnih u datom periodu života ćelije. Informacije o proteinskom molekulu su šifrirane u molekulu DNK pomoću tripleta ili kodona.

Genetski kod je sistem za snimanje informacija o sekvenci aminokiselina u proteinima koristeći sekvencu nukleotida u mRNA.

Svojstva koda:

1. Trojnost – svaka aminokiselina je šifrovana nizom od tri nukleotida. Ova sekvenca se naziva triplet ili kodon.
2. Degeneracija ili redundantnost - svaka aminokiselina je šifrirana s više od jednog kodona (od 2 do 6). Izuzetak su metionin i triptofan - svaki od njih je kodiran jednim tripletom.
3. Nedvosmisleno - svaki kodon kodira samo jednu aminokiselinu.
4. Između gena postoje "znakovi interpunkcije" - to su tri posebna tripleta (UAA, UAG, UGA), od kojih svaki ne kodira aminokiseline. Ove trojke se nalaze na kraju svakog gena. Ne postoje "znakovi interpunkcije" unutar gena.
5. Univerzalnost - genetski kod je isti za sva živa bića planete Zemlje.

U biosintezi proteina razlikuju se tri faze - transkripcija, post-transkripcijski procesi i translacija.

Transkripcija- ovo je proces sinteze mRNA, koju provodi enzim RNA polimeraza. Javlja se u jezgru. Transkripcija se vrši po pravilu komplementarnosti. Dužina mRNA odgovara jednom ili više gena. Postoje 4 faze u procesu transkripcije:

1. vezivanje RNA polimeraze za promotor (ovo je mjesto vezivanja enzima).
2. inicijacija - početak sinteze.
3. elongacija - rast RNK lanca; sekvencijalno vezivanje nukleotida jedan za drugi redom kojim se nalaze komplementarni nukleotidi lanca DNK. Njegova brzina je do 50 nukleotida u sekundi.
4. termination - završetak sinteze pre-i-RNA.

post-transkripcijskim procesima. Nakon formiranja pre-mRNA počinje sazrijevanje ili obrada mRNA. U ovom slučaju, intronski regioni se uklanjaju iz RNA molekule, nakon čega slijedi povezivanje egzonskih regija (ovaj proces se naziva spajanje). Nakon toga, zrela mRNA napušta jezgro i odlazi na mjesto sinteze proteina (do ribozoma).

Broadcast- ovo je sinteza polipeptidnih lanaca proteina, koju izvodi mRNA šablon u ribosomima.

Aminokiseline potrebne za sintezu proteina dostavljaju se ribosomima preko tRNA. Prenosni RNA molekul ima oblik lista djeteline, na čijem se vrhu nalazi niz od tri nukleotida koji su komplementarni nukleotidima kodona u mRNA. Ovaj niz se zove antikodon. Enzim (kodaza) prepoznaje tRNA i vezuje za nju odgovarajuću aminokiselinu (troši se energija jednog ATP molekula).

Biosinteza proteina počinje činjenicom (kod bakterija) da AUG kodon, koji se nalazi na prvom mjestu u kopiji svakog gena, zauzima mjesto na ribosomu na mjestu donora, a t-RNA koja nosi formilmetionin (ovo je izmijenjeni oblik aminokiseline metionin) je vezan za njega. Nakon završetka sinteze proteina, formilmetionin se cijepa iz polipeptidnog lanca.

Ribosom ima dva mjesta za vezivanje dva tRNA molekula: donator I akceptor. tRNA sa amino kiselinom ulazi u akceptorsko mjesto i veže se za svoj kodon mRNA. Aminokiselina ove t-RNA vezuje rastući proteinski lanac za sebe, a između njih nastaje peptidna veza. tRNA, za koju je vezan rastući protein, kreće se zajedno sa kodonom mRNA do donorskog mjesta ribosoma. Na ispražnjeno akceptorsko mjesto dolazi nova t-RNA sa aminokiselinom i sve se ponavlja iznova. Kada se jedan od znakova interpunkcije pojavi na ribosomu, nijedna od tRNA aminokiselina ne može zauzeti mjesto akceptora. Polipeptidni lanac se prekida i napušta ribozom.

Ćelije različitih tjelesnih tkiva proizvode različite proteine ​​(amilaze - stanice pljuvačnih žlijezda; inzulin - ćelije gušterače, itd.). Istovremeno, sve ćelije tijela su nastale iz jednog oplođenog jajeta ponovljenom diobom pomoću mitoze, tj. imaju isti genetski sastav. Ove razlike su povezane sa činjenicom da se različiti regioni DNK transkribuju u različitim ćelijama; formiraju se različite mRNA prema kojima se sintetišu proteini. Specijalizaciju ćelije određuju ne svi geni, već samo oni iz kojih su informacije pročitane i implementirane u proteine. Dakle, u svakoj ćeliji se realizuje samo dio nasljedne informacije, a ne sve informacije u cjelini.

Regulacija aktivnosti gena u sintezi pojedinačnih proteina na primjeru bakterija (šema F. Jacoba i Zh Monoda).

Poznato je da dok se šećer ne doda u hranljivu podlogu u kojoj žive bakterije, u bakterijskoj ćeliji nema enzima koji su neophodni za njenu razgradnju. Ali nekoliko sekundi nakon dodavanja šećera u ćeliji se sintetiziraju svi potrebni enzimi.

Enzimi uključeni u isti lanac transformacije supstrata u konačni proizvod se kodiraju jedan za drugim. strukturni geni jedan operon. Operan- Ovo je grupa gena koji nose informacije o strukturi proteina neophodnih za obavljanje jedne funkcije. Između strukturnih gena i promotora (mjesta slijetanja RNA polimeraze) postoji mjesto tzv. operater. Naziva se tako jer od njega počinje sinteza mRNA. Poseban protein u interakciji s operaterom - potisnik (supresor). Dok je represor na operateru, sinteza mRNA ne može početi.

Kada supstrat uđe u ćeliju, za čije cijepanje su potrebni proteini kodirani u strukturnim genima datog operona, jedan od molekula supstrata stupa u interakciju sa represorom. Represor gubi sposobnost interakcije s operaterom i udaljava se od njega; počinje sinteza i-RNA i formiranje odgovarajućih proteina na ribosomu. Čim se posljednji molekul supstrata pretvori u konačnu supstancu, oslobođeni represor će se vratiti operateru i blokirati sintezu mRNA.

Reference:

1. Y. Čencov "Uvod u ćelijsku biologiju" (2006)
2. V.N. Yarygin (urednik) "Biologija" (u dva toma, 2006.)
3. O.V. Aleksandrovskaja i ostali "Citologija, histologija i embriologija" (1987)
4. A.O. Ruvimsky (urednik) "Opća biologija" (udžbenik za 10-11 razrede sa dubinska studija biologija) - po mom mišljenju, ovo je jedan od najboljih udžbenika iz opšte biologije za kandidate, iako ne bez nedostataka.

Za napredak histologije, citologije i embriologije od velikog je značaja uvođenje dostignuća fizike i hemije, novih metoda srodnih nauka – biohemije, molekularne biologije, genetskog inženjeringa.

Savremene metode studije omogućavaju proučavanje tkiva ne samo kao cjeline, već i izolaciju pojedinačnih tipova stanica od njih kako bi se proučavala njihova vitalna aktivnost dugo vremena, izolacija pojedinačnih ćelijskih organela i njihovih makromolekula (na primjer, DNK) i proučavanje njihovih funkcionalnih karakteristika.

Takve mogućnosti su se otvorile u vezi sa stvaranjem novih instrumenata i tehnologija - raznih vrsta mikroskopa, kompjuterske tehnologije, analize difrakcije rendgenskih zraka, upotrebe nuklearne magnetne rezonancije (NMR), radioaktivnih izotopa i autoradiografije, elektroforeze i kromatografije, frakcioniranja. sadržaja ćelija ultracentrifugiranjem, odvajanjem i kultivacijom ćelija, dobijanjem hibrida; korištenje biotehnoloških metoda - dobijanje hibridoma i monoklonskih antitijela, rekombinantne DNK itd.

Dakle, biološki objekti se mogu proučavati na tkivnom, ćelijskom, subćelijskom i molekularnom nivou. Uprkos uvođenju u prirodne nauke različitih biohemijskih, biofizičkih, fizičkih i tehnoloških metoda neophodnih za rešavanje mnogih pitanja vezanih za vitalnu aktivnost ćelija i tkiva, histologija u osnovi ostaje morfološka nauka sa sopstvenim skupom metoda. Potonji omogućavaju karakterizaciju procesa koji se odvijaju u stanicama i tkivima, njihove strukturne karakteristike.

Glavne faze citološke i histološke analize su izbor predmeta proučavanja, njegova priprema za ispitivanje pod mikroskopom, korištenje mikroskopskih metoda, te kvalitativna i kvantitativna analiza slika.

Predmet proučavanja su žive i fiksne ćelije i tkiva, njihove slike dobijene svetlosnim i elektronskim mikroskopom ili na ekranu televizijskog ekrana. Postoji niz metoda koje omogućavaju analizu ovih objekata.

Metode mikroskopije histoloških preparata

Glavne metode za proučavanje bioloških mikroobjekata su svjetlosna i elektronska mikroskopija, koje se široko koriste u eksperimentalnoj i kliničkoj praksi.

Mikroskopija je glavna metoda proučavanja mikro-objekata koji se koriste u biologiji više od 300 godina. Od nastanka i upotrebe prvih mikroskopa, oni su stalno unapređivani. Moderni mikroskopi su raznovrsni složeni optički sistemi visoke rezolucije. Veličina najmanje strukture koja se može vidjeti pod mikroskopom određena je najmanjom razlučivom udaljenosti (d o ), koja uglavnom ovisi o talasnoj dužini svjetlosti. (\) i talasne dužine elektromagnetnih oscilacija toka elektrona, itd. Ova zavisnost je približno određena formulom d 0 = 1 / 2 \. Dakle, što je manja valna dužina, to je manja razlučiva udaljenost i manje su mikrostrukture koje se mogu vidjeti u preparatu. Za proučavanje histoloških preparata koriste se različite vrste svjetlosnih mikroskopa i elektronskih mikroskopa.

Rice. 1. Mikroskopi za biološka istraživanja.

A - svjetlosni biološki mikroskop "Biolam-S": 1 - baza; 2 - držač cijevi; 3 - nagnuta cijev; 4 - okular, 5 - revolver; 6 - sočiva; 7 - sto; 8 - kondenzator sa iris dijafragmom; 9 - zavrtanj kondenzatora; 10 - ogledalo; 11 - mikrometrijski vijak; 12 - makrometrijski vijak. B - elektronski mikroskop EMV-100AK sa automatizovanim sistemom za obradu slike: 1 - kolona mikroskopa (sa elektronsko-optičkim sistemom i kamerom za uzorke); 2 - kontrolna tabla; 3 - kamera sa luminiscentnim ekranom; 4 - blok za analizu slike; 5 - senzor video signala.

Svetlosna mikroskopija. Za proučavanje histoloških mikro-objekata koriste se konvencionalni svjetlosni mikroskopi i njihove varijante, koji koriste izvore svjetlosti različitih valnih dužina. U konvencionalnim svjetlosnim mikroskopima izvor osvjetljenja je prirodna ili umjetna svjetlost (slika 1, A). Minimalna talasna dužina vidljivog dela spektra je približno 0,4 µm. Stoga, za konvencionalni svjetlosni mikroskop, najmanji udaljenost rezolucije je približno 0,2 µm ( d o = "/, - 0,4 μm = 0,2 μm), a ukupno povećanje (proizvod uvećanja sočiva i uvećanja okulara) može biti 1500-2500.

Tako se u svjetlosnom mikroskopu mogu vidjeti ne samo pojedinačne ćelije veličine od 4 do 150 mikrona, već i njihove unutarćelijske strukture - organele, inkluzije. Za poboljšanje kontrasta mikro objekata koristi se njihovo bojenje.

ultraljubičasta mikroskopija. Ovo je vrsta svjetlosne mikroskopije. Ultraljubičasti mikroskop koristi kraće ultraljubičaste zrake s talasnom dužinom od oko 0,2 µm. Rezolucija je ovdje 2 puta manja nego kod konvencionalnih svjetlosnih mikroskopa i iznosi približno 0,1 μm (d o = V 2 - 0,2 μm = 0,1 μm). Slika dobijena u ultraljubičastim zracima, nevidljiva oku, pretvara se u vidljivu registracijom na fotografsku ploču ili upotrebom posebnih uređaja (luminiscentni ekran, elektronsko-optički pretvarač).

Fluorescentna (luminiscentna) mikroskopija. Fenomen fluorescencije leži u činjenici da atomi i molekuli niza supstanci, apsorbirajući zrake kratkih valova, prelaze u pobuđeno stanje. Obrnuti prijelaz iz pobuđenog stanja u normalno stanje događa se emisijom svjetlosti, ali sa većom talasnom dužinom. U fluorescentnom mikroskopu, kao izvori svjetlosti za pobuđivanje fluorescencije koriste se živine ili ksenonske sijalice ultravisokog pritiska, koje imaju visoku svjetlinu u spektralnom području od 0,25-0,4 μm (bliski ultraljubičasti zraci) i 0,4-0,5 μm (plavo-ljubičasti zraci). ). Talasna dužina fluorescentnog svjetlosnog talasa uvijek je veća od valne dužine uzbudljivog svjetla, pa se oni razdvajaju pomoću svjetlosnih filtera i slika objekta se proučava samo u fluorescentnom svjetlu. Razlikovati vlastitu, ili primarnu, i indukovanu, ili sekundarnu, fluorescenciju. Svaka ćelija živog organizma ima svoju fluorescenciju, ali je često izuzetno slaba.

Serotonin, kateholamini (adrenalin, noradrenalin) sadržani u nervnim, mastogramima i drugim ćelijama imaju primarnu fluorescenciju nakon fiksacije tkiva u parama formaldehida na 60-80 °C (Falk metoda).

Sekundarna fluorescencija nastaje kada se preparati tretiraju posebnim bojama - fluorohromima.

Postoje različiti fluorohromi koji se specifično vezuju za određene makromolekule (akridin narandžasta, rodamin, fluorescein, itd.). Na primjer, kod obrade preparata najčešće se koristi fluorohrom akridin narandžasta. U ovom slučaju, DNK i njeni spojevi u ćelijama su svijetlozeleni i RNA i njegovi derivati ​​- jarko crveni sjaj. Dakle, spektralni sastav zračenja nosi informacije o unutrašnjoj strukturi objekta i njegovom hemijskom sastavu. Varijanta metode fluorescentne mikroskopije, u kojoj se i ekscitacija i emisija fluorescencije javljaju u ultraljubičastom području spektra, naziva se metoda ultraljubičasta fluorescentna mikroskopija.

Mikroskopija faznog kontrasta. Ova metoda se koristi za dobijanje slika visokog kontrasta prozirnih i bezbojnih živih objekata koji su nevidljivi konvencionalnim metodama mikroskopije. Kao što je već spomenuto, u konvencionalnom svjetlosnom mikroskopu, potreban kontrast struktura postiže se bojenjem. Metoda faznog kontrasta omogućava kontrast proučavanih neobojenih struktura zahvaljujući specijalnoj prstenastoj dijafragmi postavljenoj u kondenzatoru i takozvanoj faznoj ploči koja se nalazi u objektivu. Ovakav dizajn mikroskopske optike omogućava pretvaranje faznih promjena svjetlosti koja prolazi kroz neobojeni preparat, a koje oko ne percipira, u promjenu njegove amplitude, tj. svjetlina rezultirajuće slike. Povećanje kontrasta omogućava vam da vidite sve strukture koje se razlikuju po indeksu prelamanja. Varijacija metode faznog kontrasta je metoda kontrast faza-tamno polje, dajući negativnu naspram pozitivnu sliku faznog kontrasta.

Mikroskopija tamnog polja. U mikroskopu tamnog polja, samo svjetlost koja difragira strukture u preparatu doseže cilj. To se događa zbog prisustva posebnog kondenzatora u mikroskopu, koji osvjetljava preparat striktno kosim svjetlom; zraci iz iluminatora su usmjereni sa strane. Tako polje izgleda tamno, a male čestice u preparatu reflektuju svjetlost koja potom ulazi u sočivo. Rezolucija ovog mikroskopa ne može biti bolja od rezolucije mikroskopa sa svijetlim poljem jer se koristi ista talasna dužina. Ali ovdje ima više kontrasta. Koristi se za proučavanje živih objekata, autoradiografskih objekata kao što su srebrna zrna koja izgledaju sjajno u tamnom polju. U klinici se koristi za proučavanje kristala u urinu (mokraćna kiselina, oksalati), za demonstraciju spiroheta, posebno treponema pallidum, koja izaziva sifilis itd.

interferentna mikroskopija. Raznovrsnosti faznog kontrastnog mikroskopa su interferentni mikroskop, koji je dizajniran za kvantifikaciju mase tkiva, i diferencijalni interferentni mikroskop (sa optikom Nomarsky), koji se posebno koristi za proučavanje površinskog reljefa ćelija i drugih bioloških objekata.

U interferentnom mikroskopu, snop svjetlosti iz iluminatora podijeljen je u dva toka: jedan prolazi kroz objekt i mijenja fazu oscilacije, drugi zaobilazi objekt. U prizmama objektiva, oba snopa su povezana i interferiraju jedan s drugim. Kao rezultat toga, stvara se slika u kojoj se dijelovi mikro-objekta različite debljine i gustoće razlikuju u kontrastu. Nakon kvantifikacije promjena, odredite koncentraciju i masu suhe tvari.

Mikroskopi faznog kontrasta i interferencije omogućavaju proučavanje živih ćelija. Oni koriste efekat interferencije koji se javlja kada se dva seta talasa kombinuju kako bi stvorili sliku mikrostruktura. Prednost faznog kontrasta, interferencije i mikroskopije tamnog polja je mogućnost posmatranja ćelija u procesu kretanja i mitoze. U ovom slučaju, kretanje ćelije se može snimiti pomoću mikrofilmiranja s vremenskim odmakom (frame-by-frame).

polarizujuća mikroskopija. Polarizacijski mikroskop je modifikacija svjetlosnog mikroskopa u koji su ugrađena dva polarizirajuća filtera - prvi (polarizator) između svjetlosnog snopa i objekta, a drugi (analizator) između sočiva objektiva i oka. Svjetlost prolazi kroz prvi filter samo u jednom smjeru, drugi filter ima glavnu os koja je okomita na prvi filter i ne propušta svjetlost. Ovo stvara efekat tamnog polja. Oba filtera se mogu rotirati kako bi se promijenio smjer svjetlosnog snopa. Ako se analizator zarotira za 90° u odnosu na polarizator, svjetlost neće proći kroz njih. Strukture koje sadrže longitudinalno orijentirane molekule (kolagen, mikrotubule, mikrofilamenti) i kristalne strukture (u Leydigovim ćelijama 1) izgledaju kao blistave kada se osa rotacije promijeni. Sposobnost kristala ili parakristalnih formacija da cijepaju svjetlosni val na običan val i val okomit na njega naziva se dvolomnost. Ovu sposobnost posjeduju fibrile prugasto-prugastih mišića.

Elektronska mikroskopija. Veliki korak naprijed u razvoju mikroskopske tehnologije bilo je stvaranje i korištenje elektronskog mikroskopa (vidi sliku 1, B). Elektronski mikroskop koristi struju elektrona kraćih talasnih dužina od svetlosnog mikroskopa. Pri naponu od 50 000 V, talasna dužina elektromagnetnih oscilacija koje nastaju kretanjem struje elektrona u vakuumu je 0,0056 nm. Teoretski je izračunato da razlučivo rastojanje pod ovim uslovima može biti oko 0,002 nm, odnosno 0,000002 µm, tj. 100.000 puta manje; nego u svetlosnom mikroskopu. U praksi, u modernim elektronskim mikroskopima, razlučiva udaljenost je oko 0,1-0,7 nm.

Trenutno se široko koriste transmisioni (transmisioni) elektronski mikroskopi (TEM) i skenirajući (skenirajući) elektronski mikroskopi (SEM). Uz pomoć TEM-a može se dobiti samo planarna slika mikroobjekta koji se proučava. Da bi se dobio prostorni prikaz struktura, koriste se SEM-ovi koji mogu stvoriti trodimenzionalnu sliku. Skenirajući elektronski mikroskop radi na principu skeniranja predmeta koji se proučava elektronskom mikrosondom, odnosno, uzastopno "opipa" pojedine tačke površine oštro fokusiranim snopom elektrona. Da bi se proučilo odabrano područje, mikrosonda se kreće duž njegove površine pod djelovanjem zavojnica (princip televizijskog skeniranja). Takvo ispitivanje objekta naziva se skeniranje (čitanje), a obrazac po kojem se mikrosonda kreće naziva se raster. Rezultirajuća slika se prikazuje na televizijskom ekranu, čiji se elektronski snop kreće sinhrono sa mikrosondom.

Glavne prednosti skenirajuće elektronske mikroskopije su velika dubina polja, širok raspon kontinuiranih promjena povećanja (od desetina do desetina hiljada puta) i visoka rezolucija.

Zamrznuta elektronska mikroskopija- chipping koristi se za proučavanje detalja strukture membrana i međustaničnih veza. Ćelije se zamrzavaju na niskoj temperaturi (-160°C) kako bi se napravio čips. Prilikom pregleda membrane, ravan cijepanja prolazi kroz sredinu lipidnog dvosloja. Sljedeće dalje unutrašnje površine metali (platina, paladijum, uranijum) se talože na polovice membrane, proučavaju se pomoću TEM i mikrofotografije.

Metoda krioelektronske mikroskopije. Brzo smrznuti tanak sloj (oko 100 nm) uzorka tkiva stavlja se na mikroskopsku rešetku i ispituje pod mikroskopskim vakuumom na -160°C.

Metoda elektronske mikroskopije "zamrzavanje- graviranje" koristi se za proučavanje vanjske površine ćelijskih membrana. Nakon brzog zamrzavanja ćelija na vrlo niskoj temperaturi, blok se otvara oštricom noža. Nastali kristali leda se uklanjaju sublimacijom vode u vakuumu. Zatim se područja ćelija zasjenjuju prskanjem tankog filma teškog metala (na primjer, platine). Metoda omogućava otkrivanje trodimenzionalne organizacije struktura.

Dakle, metode zamrzavanja-cijepanja i zamrzavanja-jetkanja omogućavaju proučavanje nefiksiranih ćelija bez stvaranja artefakata izazvanih fiksacijom u njima.

Metode kontrasta sa solima teških metala omogućavaju proučavanje pojedinačnih makromolekula - DNK, velikih proteina (na primjer, miozina) u elektronskom mikroskopu. Sa negativnim kontrastom proučavaju se agregati makromolekula (ribozomi, virusi) ili proteinski filamenti (aktinski filamenti).

Elektronska mikroskopija ultratankih isječaka dobivenih krioultramikrotomijom. Ovom metodom komadići tkiva bez fiksiranja i izlivanja u čvrste medije brzo se hlade u tečnom azotu na temperaturi od -196 °C. To osigurava inhibiciju metaboličkih procesa ćelija i prelazak vode iz tekuće faze u čvrstu. Zatim se blokovi režu na ultramikrotomu na niskoj temperaturi. Ova metoda sekcije se obično koristi za određivanje aktivnosti enzima, kao i za sprovođenje imunohemijskih reakcija. Za otkrivanje antigena koriste se antitijela povezana s česticama koloidnog zlata čiju je lokalizaciju lako identificirati na preparatima.

Metode ultravisokonaponske mikroskopije. Koriste se elektronski mikroskopi sa ubrzavajućim naponom do 3.000.000 V. Prednost ovih mikroskopa je u tome što vam omogućavaju proučavanje objekata velike debljine (1-10 mikrona), budući da ih pri visokoj energiji elektrona objekt manje apsorbuje. Stereoskopsko snimanje omogućava dobijanje informacija o trodimenzionalnoj organizaciji unutarćelijskih struktura visoke rezolucije (oko 0,5 nm).

Analiza difrakcije rendgenskih zraka. Za proučavanje strukture makromolekula na atomskom nivou, koriste se metode pomoću rendgenskih zraka s talasnom dužinom od oko 0,1 nm (prečnik atoma vodika). Molekuli koji formiraju kristalnu rešetku proučavaju se pomoću difrakcijskih obrazaca, koji se snimaju na fotografskoj ploči u obliku mnoštva mrlja različitog intenziteta. Intenzitet tačaka zavisi od sposobnosti različitih objekata u nizu da rasipaju zračenje. Položaj tačaka na difrakcijskom uzorku zavisi od položaja objekta u sistemu, a njihov intenzitet ukazuje na njegovu unutrašnju atomsku strukturu.

Metode za proučavanje fiksnih ćelija i tkiva

Proučavanje fiksnih ćelija i tkiva. Glavni predmet istraživanja su histološki preparati, napravljen od fiksnih konstrukcija. Lijek može biti bris (na primjer, bris krvi, koštane srži, pljuvačke, likvora, itd.), otisak (na primjer, slezine, timusa, jetre), film tkiva (npr. vezivno ili peritonealno, pleura, pia mater) tanak rez. Najčešće se za proučavanje koristi dio tkiva ili organa. Histološki preparati se mogu proučavati bez posebne obrade. Na primjer, pripremljeni razmaz krvi, otisak, film ili dio organa može se odmah pogledati pod mikroskopom. Ali zbog činjenice da strukture imaju "slab kontrast", one se slabo detektuju u konvencionalnom svjetlosnom mikroskopu i potrebna je upotreba posebnih mikroskopa (fazni kontrast itd.), Stoga se češće koriste posebno obrađeni preparati.

Proces izrade histološkog preparata za svjetlosnu i elektronsku mikroskopiju uključuje sljedeće glavne korake: 1) uzimanje materijala i njegovo fiksiranje, 2) zbijanje materijala, 3) pripremu rezova, 4) bojenje ili kontrastiranje rezova. Za svetlosnu mikroskopiju neophodan je još jedan korak - zaključivanje preseka u melemu ili drugom providnom mediju (5). Fiksacija osigurava prevenciju procesa raspadanja, što pomaže u očuvanju integriteta struktura. To se postiže činjenicom da se mali uzorak uzet iz organa ili uroni u fiksativ (alkohol, formalin, otopine soli teških metala, osmička kiselina, specijalne mješavine fiksatora) ili se podvrgne toplinskoj obradi. Pod dejstvom fiksatora u tkivima i organima nastaju složene fizičko-hemijske promene. Najznačajniji od njih je proces ireverzibilne koagulacije proteina, zbog čega vitalna aktivnost prestaje, a strukture postaju mrtve, fiksirane. Fiksacija dovodi do zbijanja i smanjenja volumena komada, kao i do poboljšanja naknadnog bojenja stanica i tkiva.

zaptivni komadi, neophodan za pripremu preseka, izrađuje se impregnacijom prethodno dehidriranog materijala parafinom, celoidinom, organskim smolama. Brže sabijanje postiže se metodom zamrzavanja komada, na primjer u tečnoj ugljičnoj kiselini.

Priprema sekcije proizvedeno na posebnim uređajima - mikrotomi(za svjetlosnu mikroskopiju) i ultramikrotomi(za elektronsku mikroskopiju).

Bojenje sekcija(u svjetlosnoj mikroskopiji) ili prskajući ih solima metala(u elektronskoj mikroskopiji) se koristi za povećanje kontrasta slike pojedinačnih struktura kada se gleda pod mikroskopom. Metode za bojenje histoloških struktura vrlo su raznolike i odabiru se ovisno o ciljevima studije. Histološke boje dijele se na kisele, bazične i neutralne. Primjeri uključuju najpoznatiju bazičnu boju, azur II, koja boji jezgre u ljubičasto, i kiselu boju, eozin, koja boji citoplazmu u ružičasto-narandžasto. Selektivni afinitet struktura za određene boje je posljedica njihovog kemijskog sastava i fizičkih svojstava. Strukture koje se dobro boje kiselim bojama nazivaju se oksifilan(acidofilni, eozinofilni) i bazično bojenje - bazofilni. Strukture koje prihvataju i kisele i bazične boje su neutrofilna(heterofilna). Obojeni preparati se obično dehidriraju u alkoholima sve jačine i bistre u ksilenu, benzenu, toluenu ili nekim uljima. Za dugotrajno očuvanje, dehidrirani histološki rez je zatvoren između stakalca i pokrovnog stakla u kanadskom balzamu ili drugim supstancama. Gotovi histološki preparat može se koristiti za mikroskopski pregled dugi niz godina. Za elektronsku mikroskopiju, preseci dobijeni na ultramikrotomu postavljaju se na posebne rešetke, u kontrastu sa solima mangana, kobalta itd., nakon čega se pregledavaju pod mikroskopom i fotografišu. Dobijene mikrofotografije služe kao predmet proučavanja uz histološke preparate.

Metode za proučavanje živih ćelija i tkiva

Proučavanje živih stanica i tkiva omogućava vam da dobijete najpotpunije informacije o njihovom životu - da pratite kretanje, procese diobe, uništenja, rasta, diferencijacije i interakcije stanica, trajanje njihovog životnog ciklusa, reaktivne promjene u odgovoru. na djelovanje raznih faktora.

In vivo studije ćelija u telu (invivo). Jedna od vitalnih metoda istraživanja je posmatranje struktura u živom organizmu. Uz pomoć specijalnih prozirnih mikroskopa-iluminatora, na primjer, moguće je proučavati dinamiku cirkulacije krvi u mikrožilama. Nakon anestezije kod životinje, predmet proučavanja (npr. mezenterij crijeva) se vadi i pregledava pod mikroskopom, dok se tkiva moraju stalno vlažiti izotoničnom otopinom natrijum hlorida. Međutim, trajanje takvog posmatranja je ograničeno. Najbolji rezultati se postižu implantacijom prozirnih komora u tijelo životinje.

Najprikladniji organ za implantaciju takvih kamera i naknadno promatranje je uho životinje (na primjer, zeca). Presjek uha sa providnom komorom postavlja se na scenu mikroskopa i pod tim uslovima se proučava dinamika promjena u ćelijama i tkivima tokom dužeg vremenskog perioda. Tako se mogu proučavati procesi izbacivanja leukocita iz krvnih sudova, različite faze formiranja vezivnog tkiva, kapilara, nerava i drugi procesi. Oko eksperimentalnih životinja može se koristiti kao prirodna prozirna kamera. Uzorci ćelija, tkiva ili organa se stavljaju u tečnost prednje očne komore pod uglom koji formiraju rožnjača i šarenica i mogu se posmatrati kroz prozirnu rožnjaču. Na taj način je presađeno oplođeno jaje i praćeni su rani stadijumi embrionalnog razvoja. Majmunima su presađeni mali komadi materice i proučavane promjene na sluznici materice u različitim fazama menstrualnog ciklusa.

Metoda transplantacije krvi i stanica koštane srži sa zdravih životinja donora na životinje koje su bile podvrgnute smrtonosnom zračenju našla je široku primjenu. Životinje primateljice nakon transplantacije ostale su žive zbog presađivanja donorske ćelije koje formiraju kolonije hematopoetskih ćelija u slezeni. Proučavanje broja kolonija i njihovog staničnog sastava omogućava identifikaciju broja roditeljskih hematopoetskih stanica i različite faze njihove diferencijacije. Metodom formiranja kolonija utvrđeni su izvori razvoja svih krvnih stanica.

Vitalno i supravitalno bojenje. Prilikom vitalnog (doživotnog) bojenja ćelija i tkiva, boja se unosi u organizam životinje, a selektivno boji određene ćelije, njihove organele ili međućelijsku tvar. Na primjer, pomoću tripan plavog ili litijum karmina, fagociti se detektuju, a pomoću alizarina, novoformirani koštani matriks.

Supravitalno bojenje se odnosi na bojenje živih ćelija izolovanih iz tijela. Na taj način se otkrivaju mladi oblici eritrocita - krvni retikulociti (briljantna krezil plava boja), mitohondrije u ćelijama (Janus zelena boja), lizozomi (neutralna crvena boja).

Studije živih ćelija i tkiva u kulturi (invitro). Ova metoda je jedna od najčešćih. Ćelije izolirane iz ljudskog ili životinjskog tijela, mali uzorci tkiva ili organa stavljaju se u staklene ili plastične posude koje sadrže poseban hranljivi medij - krvnu plazmu, embrionalni ekstrakt, kao i umjetne podloge. Postoje suspenzijske kulture (ćelije suspendovane u medijumu), kulture tkiva, organa i jednoslojne kulture (eksplantirane ćelije formiraju kontinuirani sloj na staklu). Osigurana je sterilnost podloge i temperatura koja odgovara tjelesnoj temperaturi. U ovim uvjetima, ćelije dugo zadržavaju glavne pokazatelje vitalne aktivnosti - sposobnost rasta, reprodukcije, diferencijacije i kretanja. Takve kulture mogu postojati mnogo dana, mjeseci, pa čak i godina ako se podloga za kulturu obnovi i vitalne ćelije transplantiraju u druge sudove. Neke vrste ćelija, zbog promjena u njihovom genomu, mogu opstati i razmnožavati se u kulturi, formirajući kontinuirane ćelijske linije. A. A. Maksimov, A. V. Rumjancev, N. G. Hlopin, A. D. Timofejevski i F. M. Lazarenko dali su veliki doprinos razvoju metoda za kultivaciju ćelija i tkiva. Trenutno su dobijene ćelijske linije fibroblasta, miocita, epiteliocita, makrofaga itd., koje postoje dugi niz godina.

Upotreba metode uzgoja omogućila je otkrivanje niza obrazaca diferencijacije, maligne transformacije stanica, staničnih interakcija, interakcija stanica s virusima i mikrobima. Prikazana je sposobnost ćelija hrskavice da formiraju međućelijsku tvar u kulturi i sposobnost stanica nadbubrežne žlijezde da proizvode hormone. Uzgoj embrionalnih tkiva i organa omogućio je praćenje razvoja kostiju, kože i drugih organa. Razvijena je tehnika kultivacije nervnih ćelija.

Metoda kulture tkiva je od posebnog značaja za provođenje eksperimentalnih opservacija na ljudskim ćelijama i tkivima. Ćelije uzete iz ljudskog tijela tokom punkcije ili biopsije mogu se koristiti u kulturi tkiva za određivanje spola, nasljednih bolesti, maligne degeneracije i za identifikaciju djelovanja niza toksičnih supstanci.

Posljednjih godina, ćelijske kulture su se naširoko koristile za hibridizaciju stanica.

Razvijene su metode za odvajanje tkiva u ćelije, izolaciju pojedinačnih tipova ćelija i njihovo kultivisanje.

Najprije se tkivo pretvara u ćelijsku suspenziju uništavanjem međućelijskih kontakata i međućelijskog matriksa uz pomoć proteolitičkih enzima (tripsin, kolagenaza) i spojeva koji vezuju Ca 2+ (pomoću EDTA - etilendiamintetrasirćetne kiseline). Nadalje, dobivena suspenzija se centrifugiranjem razdvaja na frakcije ćelija različitih tipova, što omogućava odvajanje težih ćelija od lakših, velikih od malih, ili lijepljenjem ćelija za staklo ili plastiku, čija je sposobnost različita za različite vrste ćelije. Da bi se osiguralo specifično prianjanje ćelija na staklenu površinu, koriste se antitijela koja se specifično vezuju za ćelije istog tipa. Prianjajuće ćelije se zatim odvajaju razbijanjem matriksa enzimima, čime se dobija suspenzija homogenih ćelija. Suptilnija metoda razdvajanja ćelija je obilježavanje antitijelima povezanim s fluorescentnim bojama. Obilježene ćelije se odvajaju od neobilježenih pomoću sortera (elektronski fluorescentno aktivirani ćelijski analizator). Analizator ćelija sortira u 1 sa oko 5000 ćelija. Izolovane ćelije se mogu proučavati u uslovima kulture.

Metoda kultivacije ćelija omogućava proučavanje njihove vitalne aktivnosti, reprodukcije, diferencijacije, interakcije sa drugim ćelijama, uticaja hormona, faktora rasta itd.

Kulture se obično pripremaju iz ćelijske suspenzije pripremljene gore opisanom metodom disocijacije tkiva. Većina ćelija nije u stanju da raste u suspenziji, potrebna im je čvrsta površina, što je površina plastične posude za kulturu, ponekad sa komponentama ekstracelularnog matriksa, kao što je kolagen. Primarni usevi nazivaju se kulture pripremljene odmah nakon prve faze ćelijske frakcije, sekundarno- ćelijske kulture presađene iz primarnih kultura u novi medij. Ćelije se mogu transplantirati uzastopno tokom nedelja i meseci, dok ćelije zadržavaju svoje karakteristične znakove diferencijacije (na primer, epitelne ćelije formiraju slojeve). Početni materijal za ćelijske kulture su obično fetalna i neonatalna tkiva.

Kao hranljive podloge koriste se mješavine soli, aminokiselina, vitamina, konjskog seruma, ekstrakta pilećeg embriona, embrionalnog seruma i dr. Razvijene su posebne podloge za kultivaciju različitih tipova ćelija. Sadrže jedan ili više proteinskih faktora rasta neophodnih za život i reprodukciju ćelija. Na primjer, faktor rasta nerava (NGF) je neophodan za rast nervnih ćelija.

Većina ćelija u kulturi ima određeni broj dioba (50-100), a zatim umiru. Ponekad se u kulturi pojavljuju mutantne ćelije koje se beskonačno razmnožavaju i formiraju staničnu liniju (fibroblasti, epiteliociti, mioblasti, itd.). Mutantne ćelije se razlikuju od ćelija raka, koje su također sposobne za kontinuiranu diobu, ali mogu rasti bez pričvršćivanja na čvrstu površinu. Ćelije raka u posudama za kulturu čine gušću populaciju od normalnih staničnih populacija. Slično svojstvo može se eksperimentalno inducirati u normalnim stanicama transformirajući ih tumorskim virusima ili kemijskim spojevima, što rezultira stvaranjem neoplastično transformiranih staničnih linija. Ćelijske linije netransformisanih i transformisanih ćelija mogu se dugo čuvati na niskim temperaturama (-70 °C). Genetska homogenost ćelija se pojačava kloniranjem, kada se iz jedne ćelije dobije velika kolonija homogenih ćelija tokom njene uzastopne deobe. Klon je populacija ćelija izvedena iz jedne progenitorske ćelije.

ćelijski hibridi. Kada se dvije ćelije različitih tipova spoje, nastaje heterokarion - ćelija sa dva jezgra. Da bi se dobio heterokarion, suspenzija stanica se tretira polietilen glikolom ili inaktiviranim virusima kako bi se oštetili stanični plazmolemi, nakon čega su stanice sposobne za fuziju. Na primjer, neaktivno jezgro pilećeg eritrocita postaje aktivno (sinteza RNK, replikacija DNK) kada se stanice spajaju i prenose u citoplazmu druge ćelije koja raste u kulturi tkiva. Heterokarion je sposoban za mitozu, što rezultira stvaranjem hibridna ćelija.Školjke jezgara heterokariona su uništene, a njihovi hromozomi su spojeni u jedno veliko jezgro.

Kloniranje hibridnih ćelija dovodi do stvaranja hibridnih ćelijskih linija koje se koriste za proučavanje genoma. Na primjer, u hibridnoj ćelijskoj liniji miš-ljud, ustanovljena je uloga ljudskog hromozoma 11 u sintezi inzulina.

Hibridomi. Hibridomske ćelijske linije se koriste za dobijanje monoklonskih antitijela. Antitijela proizvode plazma ćelije, koje se formiraju iz B-limfocita tokom imunizacije. Specifična vrsta antitijela se dobija imunizacijom miševa specifičnim antigenima. Ako se takvi imunizirani limfociti kloniraju, može se dobiti velika količina homogenih antitijela. Međutim, životni vijek B-limfocita u kulturi je ograničen. Stoga se spajaju sa "besmrtnim" tumorskim ćelijama (B-limfomi). Kao rezultat, formiraju se hibridi. (hibridna ćelija, sa genomom iz dvije različite ćelije; ohm - koji se završavaju nazivima tumora). Takvi hibridomi mogu se dugo umnožavati u kulturi i sintetizirati antitijela određenog tipa. Svaki hibridomski klon je izvor monoklonskih antitijela. Svi molekuli antitijela date vrste imaju istu specifičnost vezanja antigena. Moguće je generirati monoklonska antitijela protiv bilo kojeg proteina sadržanog u ćeliji i koristiti ih za lokalizaciju proteina u ćeliji, kao i za izolaciju proteina iz mješavine (pročišćavanje proteina), što omogućava proučavanje strukture i funkcije proteina. . Monoklonska antitijela se također koriste u tehnologiji kloniranja gena.

Antitijela se mogu koristiti za proučavanje funkcije različitih molekula uvođenjem kroz plazmalemu direktno u citoplazmu stanica tankom staklenom pipetom. Na primjer, uvođenje antitijela na miozin u citoplazmu oplođenog jajeta morski jež zaustavlja podjelu citoplazme.

Rekombinantna DNK tehnologija. Klasične genetske metode omogućavaju proučavanje funkcije gena analizom fenotipova mutantnih organizama i njihovih potomaka. Tehnologija rekombinantne DNK dopunjuje ove metode, omogućavajući detaljnu hemijsku analizu genetskog materijala i proizvodnju velikih količina ćelijskih proteina.

Metode hibridizacije se široko koriste u modernoj biologiji za proučavanje strukture gena i njihove ekspresije.

Metode za proučavanje hemijskog sastava i metabolizma ćelija i tkiva

Za proučavanje kemijskog sastava bioloških struktura - lokalizacije tvari, njihove koncentracije i dinamike u metaboličkim procesima, koriste se posebne metode istraživanja.

cito- I histohemijske metode. Ove metode omogućavaju otkrivanje lokalizacije različitih hemikalija u strukturama ćelija, tkiva i organa - DNK, RNK, proteina, ugljenih hidrata, lipida, aminokiselina, minerala, vitamina, aktivnosti enzima. Ove metode se zasnivaju na specifičnosti reakcije između hemijskog reagensa i supstrata koji je deo ćelijskih i tkivnih struktura, kao i na bojenju produkata hemijske reakcije. Enzimska kontrola se često koristi za povećanje specifičnosti reakcije. Na primjer, za otkrivanje ribonukleinske kiseline (RNA) u stanicama, često se koristi galocijanin - boja s osnovnim svojstvima i prisustvom RNA potvrđeno kontrolnim tretmanom ribonukleazom, koja cijepa RNK. Galocijaninske mrlje RNA plavo-ljubičastom. Ako je presek prethodno tretiran ribonukleazom, a zatim obojen galocijaninom, tada odsustvo bojenja potvrđuje prisustvo ribonukleinske kiseline u strukturi. Brojne cito- i histohemijske metode opisane su u posebnim priručnicima.

Poslednjih godina, kombinacija histohemijskih metoda sa metodom elektronske mikroskopije dovela je do razvoja novog obećavajuće oblasti - elektronske histohemije. Ova metoda omogućava proučavanje lokalizacije različitih hemikalija ne samo na ćelijskom, već i na subćelijskom i molekularnom nivou.

Za proučavanje ćelijskih makromolekula koriste se vrlo osjetljive metode korištenjem radioaktivnih izotopa i antitijela, što omogućava otkrivanje čak i malog sadržaja molekula (manje od 1000).

radioaktivnih izotopa prilikom raspada jezgra emituju nabijene čestice (elektrone) ili zračenje (na primjer, gama zrake), koje se mogu registrovati u posebnim uređajima. Radioaktivni izotopi se koriste u radioautografiji. Na primjer, uz pomoć radioizotopa 3 H-timidina, ispituje se nuklearna DNK, uz pomoć 3 H-uridina - RNK.

radioautografska metoda. Ova metoda omogućava najpotpunije proučavanje metabolizma u različitim strukturama. Metoda se zasniva na upotrebi radioaktivnih elemenata (na primjer, fosfor - 32 P, ugljik - 14 C, sumpor - 35 S, vodonik - 3 H) ili spojeva označenih njima. Radioaktivne supstance u histološkim rezovima se detektuju pomoću fotografske emulzije, koja se nanosi na preparat i zatim razvija. U područjima lijeka, gdje fotografska emulzija dolazi u kontakt sa radioaktivnom tvari, dolazi do fotoreakcije uslijed koje se formiraju osvijetljena područja (tragovi). Ova metoda se može koristiti za određivanje, na primjer, brzine ugradnje označenih aminokiselina u proteine, formiranja nukleinskih kiselina, metabolizma joda u stanicama štitnjače itd.

Metode imunofluorescentne analize. Upotreba antitela. Antitijela su zaštitni proteini koje proizvode plazma ćelije (derivati ​​B-limfocita) kao odgovor na djelovanje stranih supstanci (antigena). Broj različitih oblika antitijela dostiže milion. Svako antitijelo ima mjesta za "prepoznavanje" molekula koji su izazvali sintezu ovog antitijela. Zbog visoke specifičnosti antitijela za antigene, mogu se koristiti za otkrivanje bilo kojeg ćelijskog proteina. Da bi se utvrdila lokalizacija proteina, antitijela se boje fluorescentnim bojama, a zatim se stanice ispituju pomoću fluorescentne mikroskopije. Antitela se takođe mogu koristiti za proučavanje antigena na ultrastrukturnom nivou pomoću elektronskog mikroskopa. Za to su antitijela označena česticama gustim elektronima (koloidne zlatne mikrosfere). Da bi se pojačala specifičnost reakcije, koriste se monoklonska antitijela, formirana od stanične linije - klonova dobivenih hibridomskom metodom iz jedne stanice. Metoda hibridoma omogućava dobijanje monoklonskih antitijela sa istom specifičnošću iu neograničenim količinama.

Metode imunofluorescentne analize se široko i efikasno koriste u modernoj histologiji. Ove metode se koriste za proučavanje procesa diferencijacije ćelija, za identifikaciju specifičnih hemijskih jedinjenja i struktura u njima. Zasnivaju se na reakcijama antigen-antitijelo. Svaka ćelija u telu ima specifičan antigenski sastav, koji je uglavnom određen proteinima. Reakcioni proizvodi se mogu obojiti i detektovati u fluorescentnom mikroskopu, na primer, detekcijom aktina i tubulina u ćeliji korišćenjem metode imunofluorescentne analize (videti poglavlje IV).

Savremene metode istraživanja omogućavaju analizu hemijskog sastava različitih strukturnih komponenti ćelija, fiksnih i živih. Proučavanje pojedinačnih intracelularnih struktura postalo je moguće nakon razvoja tehnologija frakcioniranja ćelijskog sadržaja.

Frakcionisanje ćelijskog sadržaja

Ćelijske strukture i makromolekule mogu se frakcionisati različitim metodama – ultracentrifugiranjem, hromatografijom, elektroforezom. Ove metode su detaljnije opisane u udžbenicima biohemije.

Ultracentrifugiranje. Koristeći ovu metodu, ćelije se mogu podijeliti na organele i makromolekule. Prvo, stanice se uništavaju osmotskim šokom, ultrazvukom ili mehaničkim djelovanjem. U ovom slučaju, membrane (plazmolema, endoplazmatski retikulum) se raspadaju na fragmente iz kojih se formiraju najmanji mjehurići, a jezgra i organele (mitohondrije, Golgijev aparat, lizozomi i peroksizomi) ostaju netaknuti i nalaze se u formiranoj suspenziji.

Centrifuga velike brzine (80.000-150.000 o/min) koristi se za odvajanje gornjih komponenti ćelije. Prvo, veći dijelovi (jezgra, citoskelet) se talože (sediment) na dnu epruvete. Daljnjim povećanjem brzine centrifugiranja frakcija supernatanta, uzastopno se talože manje čestice - prvo mitohondrije, lizozomi i peroksizomi, zatim mikrozomi i najmanji vezikuli, a na kraju ribozomi i velike makromolekule. Tokom centrifugiranja, različite frakcije se talože različitim brzinama, formirajući odvojene trake u epruveti, koje se mogu izolovati i ispitati. Frakcionisani ekstrakti ćelija (sistemi bez ćelija) se široko koriste za proučavanje intracelularnih procesa, na primer, za proučavanje biosinteze proteina, dešifrovanje genetskog koda itd.

Kromatografija se široko koristi za frakcioniranje proteina.

Elektroforeza omogućava odvajanje proteinskih molekula s različitim nabojem stavljanjem njihovih vodenih otopina (ili u čvrstu poroznu matricu) u električno polje.

Metode hromatografije i elektroforeze koriste se za analizu peptida dobijenih cijepanjem proteinske molekule i za dobijanje tzv. peptidnih mapa proteina. Ove metode su detaljno opisane u udžbenicima biohemije.

Proučavanje hemijskog sastava živih ćelija. Za proučavanje distribucije supstanci i njihovog metabolizma u živim ćelijama koriste se tehnike nuklearne magnetne rezonancije i mikroelektroda.

Nuklearna magnetna rezonanca (NMR) omogućava proučavanje malih molekula supstanci male molekularne težine. Uzorak tkiva sadrži atome u različitim molekulima i u različitim sredinama, tako da će apsorbirati energiju na različitim rezonantnim frekvencijama. Dijagram apsorpcije na rezonantnim frekvencijama za dati uzorak bit će njegov spektar NMR. U biologiji, NMR signal od protona (jezgra vodika) se široko koristi za proučavanje proteina, nukleinskih kiselina, itd. Za proučavanje makromolekula unutar žive ćelije, 3 H, 13 C, 35 K, 31 P izotopi se često koriste za dobijanje NMR signal i praćenje njegove promjene tokom života ćelije. Dakle, 3| P se koristi za proučavanje mišićne kontrakcije - promjene sadržaja ATP-a i neorganskog fosfata u tkivima. Izotop 13 C omogućava proučavanje mnogih procesa u kojima je glukoza uključena pomoću NMR. Upotreba NMR-a ograničena je njegovom niskom osjetljivošću: 1 g živog tkiva mora sadržavati najmanje 0,2 mm ispitivane tvari. Prednost metode je njena neškodljivost za žive ćelije.

Mikroelektrodna tehnologija. Mikroelektrode su staklene cijevi napunjene električno provodljivom otopinom (obično otopinom KC1 u vodi), čiji se krajnji promjer mjeri u frakcijama mikrona. Vrh takve epruvete se može kroz plazmalemu uvesti u citoplazmu ćelije i odrediti koncentraciju jona H+, Na+, K+, C1", Ca 2+, Mg 2+, potencijalnu razliku u plazmi. membranu, a i ubrizgavaju molekule u ćeliju.Za određivanje koncentracije određenog jona koriste se jonoselektivne elektrode koje su punjene smolom za izmjenu jona koja je propusna samo za ovaj ion.Posljednjih godina tehnologija mikroelektroda je korišćen za proučavanje transporta jona kroz posebne jonske kanale (specijalizovane proteinske kanale) u plazma membrani. U ovom slučaju koristi se mikroelektroda sa debljim vrhom, koja je čvrsto pritisnuta uz odgovarajući deo plazmaleme. Ova metoda omogućava da proučavate funkciju jedne proteinske molekule. Promjena koncentracije jona unutar ćelije može se odrediti pomoću luminiscentnih indikatora. Na primjer, za proučavanje unutarćelijske koncentracije Ca 2+, koristi se luminiscentni protein akvarin (izolovan iz meduze). , koji zrači svetlost t u prisustvu Ca 2+ jona i reaguje na promene koncentracije potonjeg u opsegu od 0,5-10 μM. Sintetizirani su i fluorescentni indikatori koji se snažno vezuju za Ca 2+. Stvaranje različitih novih tipova intracelularnih indikatora i modernih metoda analize slike omogućavaju precizno i ​​brzo određivanje intracelularne koncentracije mnogih tvari male molekularne težine.

Kvantitativne metode

Trenutno su, uz kvalitativne metode, razvijene i koriste se kvantitativne histohemijske metode za određivanje sadržaja različitih supstanci u ćelijama i tkivima. Odlika kvantitativno-histohemijskih (za razliku od biohemijskih) istraživačkih metoda je mogućnost proučavanja koncentracije i sadržaja hemijskih komponenti u specifičnim ćelijskim i tkivnim strukturama.

Citospektrofotometrija- metoda kvantitativnog proučavanja intracelularnih supstanci prema njihovim spektrima apsorpcije.

Citospektrofluorometrija- metoda za kvantitativno proučavanje intracelularnih supstanci po spektru fluorescencije ili po intenzitetu fluorescencije na jednoj prethodno odabranoj talasnoj dužini (citofluorometrija).

Moderni mikroskopi - citofluorimetri omogućavaju detekciju malih količina supstance u različitim strukturama (do 10-14 -10-16 g) i procenu lokalizacije ispitivanih supstanci u mikrostrukturama.

Metode za analizu slike ćelijskih i tkivnih struktura

Dobijene slike mikroobjekata u mikroskopu, na televizijskom ekranu, na elektronskim mikrofotografijama mogu se podvrgnuti posebnoj analizi – identifikaciji morfometrijskih, denzitometrijskih parametara i njihovoj statističkoj obradi.

Morfometrijske metode omogućavaju da se pomoću posebnih mreža (E. Veibel, A. A. Glagolev, S. B. Stefanova) odredi broj bilo kojih struktura, njihove površine, prečnici, itd. citoplazmatski odnosi itd. Postoje ručna morfometrija i automatska morfometrija, u kojoj se svi parametri automatski mjere i snimaju u uređaju.

Posljednjih godina sve je rasprostranjeniji automatizacijaintegrisani sistemi za obradu slike (ASOIS), omogućavajući najefikasnije sprovođenje gore navedenih kvantitativnih metoda za proučavanje ćelija i tkiva. Istovremeno, analitičke mogućnosti kvantitativne mikroskopije dopunjuju se metodama analize i prepoznavanja uzoraka na osnovu obrade pomoću elektronskih računara (računara) informacija ekstrahovanih iz slika ćelija i tkiva. U suštini, možemo govoriti o uređajima koji ne samo da poboljšavaju optičke mogućnosti ljudskog vizualnog analizatora, već i uvelike proširuju njegove analitičke mogućnosti. Iznosi se mišljenje da ASOIz pravi istu revoluciju u morfologiji, koja se dogodila prije oko 300 godina zbog pronalaska svjetlosnog mikroskopa, a prije 50-ak godina - elektronskog mikroskopa, jer ne samo da nemjerljivo povećavaju produktivnost istraživača i ne samo da objektiviziraju zapažanja, već i omogućavaju dobijanje novih informacija o procesima koji se ranije nisu mogli detektovati, numerički modelirati i predvidjeti njihov razvoj u ćelijama i tkivima.

Istovremeno, učešće u kompjuterskom eksperimentu zahteva od istraživača novi pristup njegovom izvođenju, veštinu sastavljanja algoritama za istraživački proces, tačnost rezonovanja i, na kraju, povećanje naučnog i metodološkog nivoa. istraživanja.

Jedna od metoda koja je značajno proširila broj morfoloških problema za rješavanje je optičko-strukturna mašinska analiza (OSMA), koju je 1965. predložio K.M. Bogdanov. Godine 1978. autor metode je nagrađen Državnom nagradom SSSR-a. Pojavom OSMA-e napravljen je kvalitativno novi korak u razvoju jedinstvene metodologije za kvantitativnu analizu mikrostruktura zasnovane na statističkim karakteristikama. Nedavno je OSMA pronašao efektivna primena u istraživačkoj praksi i nacionalnoj ekonomiji.

Na sl. 2 prikazan je sistem automatske obrade slike Protva-MP koji je u našoj zemlji kreirao LOMO. Sistem je dizajniran za kompleksna istraživanja ćelija i tkiva pomoću apsorpcione, fluorescentne mikroskopije i autoradiografije.

Specijalni skenirajući optički ili elektronski mikroskop, koji je dio sistema, sekvencijalno skenira sliku preparata u dvije koordinate, pretvara je u digitalni oblik i unosi u kompjuter, koji zauzvrat digitalno obrađuje sliku i daje informacije o geometrijskim i drugim karakteristikama analiziranog objekta.

Koristeći displej u boji, istraživač može da "secira" sliku, ističući samo one strukturne komponente koje ga zanimaju. Kapacitetni uređaji za skladištenje informacija uključeni u računar na magnetne diskove ili trake omogućavaju skladištenje i samih slika i rezultata njihove obrade za naknadno skladištenje i dokumentaciju.

Razmotrit ćemo korištenje metoda za automatiziranu analizu mikro-objekata na primjeru obrade slike krvnog leukocita (slika 3) Skenirajući mikroskop-fotometar vam omogućava da "pregledate" vrijednosti optičke gustoće red po red sa korakom koji odredi istraživač. Kao rezultat toga, optički signal koji odgovara optičkoj gustoći objekta se pretvara u digitalni oblik. Rezultirajuća digitalna matrica podliježe pripremi pomoću posebnog matematičkog aparata

Prvo se uklanja pozadina i izoluje se "čist" objekat - slika ćelije (1a), zatim se sa slike ćelije bira bilo koji detalj od interesa za istraživača, na primer, citoplazma (16) i jezgro (I reda srednja i integralna vrednost optičke gustine, disperzije, asimetrije, ekscesa itd. Na osnovu slike objekta dobijaju se morfometrijski parametri: površina, perimetar, prečnik, nuklearno-citoplazmatski odnos, faktor oblika itd.

Sljedeća faza obrade slike je izgradnja dvodimenzionalnih dijagrama međuzavisnosti optičke gustoće za cijelu ćeliju (vidi sliku 3), njenu citoplazmu (Wb) i jezgro (Nm) i jezgra. Ovi dijagrami vam omogućavaju da izračunate parametri histograma drugog reda - homogenost, lokalni kontrast, entropija itd.

Rice. 3. Automatska obrada slike ćelije (dijagram).

Slika leukocita (a), njegove citoplazme (b) i jezgra (c). I - digitalna slika; II - histogrami optičke gustine; III - dvodimenzionalni histogrami zavisnosti vrednosti optičke gustine.

Parametri dobijeni na ovaj način predstavljaju višedimenzionalni "portret" ćelije i imaju specifičan numerički izraz. Mogu biti podvrgnuti različitim metodama statističke obrade, omogućavaju izuzetno preciznu klasifikaciju mikro-objekata, otkrivaju karakteristike njihove strukture koje se vizuelno ne mogu detektovati.

Glavne metode citoloških istraživanja su svjetlosna i elektronska mikroskopija, tj. korištenje svjetlosnih i elektronskih mikroskopa koji vam omogućavaju da vidite vanjsku i unutrašnju strukturu ćelija.

Svjetlosni mikroskopi omogućuju, između ostalog, promatranje živih stanica (obično se za to koriste jednoćelijski organizmi, krvna zrnca). Međutim, rezolucija svjetlosnih mikroskopa nije tako visoka kao ona kod elektronskih mikroskopa. Rezolucija uređaja za uvećanje je minimalna udaljenost između dvije tačke koje se mogu vidjeti odvojeno. Za svjetlosne mikroskope ovo rastojanje se mjeri u stotinama nanometara, a za elektronske mikroskope u desetinama i jedinicama nanometara. Ako prvi koristi svjetlosni tok (rezolucija je obrnuto proporcionalna valnoj dužini), onda drugi koristi tok elektrona.

Postoje dvije vrste elektronskih mikroskopa - transmisioni i skenirajući. Rezolucija prvog je nešto veća, ali uz pomoć drugog može se dobiti trodimenzionalna slika. Za transmisione mikroskope pripremaju se vrlo tanki preseci kroz koje prolazi elektronski snop. U skenirajućim mikroskopima, snop elektrona se odbija od objekta.

Koristi se i u citologiji metoda fluorescentne mikroskopije, što leži u činjenici da se živim stanicama dodaju određene tvari za bojenje koje, u kombinaciji s različitim komponentama ćelije, počinju svijetliti. Dakle, ćelijske strukture (hloroplasti, mikrotubule, itd.) se mogu posmatrati u svetlosnom mikroskopu.

Osim mikroskopije, u modernoj citologiji koriste se i druge metode istraživanja. Citokemijska metoda omogućava vam učenje hemijski sastavćelije. Ova metoda se zasniva na hemijske reakcije određene supstance. Dodavanjem reagensa ćelijama moguće je otkriti prisustvo DNK, određenih proteina i sl. u njima, kao i odrediti njihovu količinu.

Metoda radio-autografije uključuje uvođenje supstance koja sadrži označene (radioaktivne) atome. Nakon nekog vremena, obilježeni molekuli se uključuju u biopolimere stanice i mogu se koristiti za praćenje tijeka metaboličkih procesa u ćeliji.

Od 20-ih godina XX vijeka, takva metoda citološkog istraživanja kao što je centrifugiranje (ili metoda frakcioniranja ćelijskih struktura). Zasnovan je na činjenici da ćelijske strukture imaju različite mase i da se talože različitim brzinama tokom centrifugiranja. Dakle, ako se ćelije unište, tada će se nakon centrifugiranja smjesa podijeliti na frakcije, gdje će na dnu biti teže strukture (obično ćelijske jezgre), a na vrhu - lakše.

Relativno nov je metoda kulture ćelija, koji omogućava uzgoj identičnih ćelija (kolonija) iz jedne ili više početnih ćelija izvan tijela pod posebno stvorenim uvjetima. Ova metoda omogućava proučavanje svojstava njegovih ćelija odvojeno od tijela, provođenje citoloških, genetskih i drugih istraživanja.

Nova metoda citološkog istraživanja je mikrohirurška metoda. Uz pomoć mikromanipulatora spojenog na mikroskop iz ćelija se izvlače ili unose različite komponente, unose supstance.

Murmansk State Technical University

Odsjek za biologiju

Izvještaj na temu:

"Metode istraživanja u citologiji"

Završeno:

Student 1. godine

Tehnološki fakultet

Odsjeci za biologiju

Serebrjakova Lada Vjačeslavovna

Provjereno:

Murmansk2001

Plan:

1. Šta proučava citologija.

2. Ideja da se organizmi sastoje od ćelija.

3. Metode istraživanja koje se koriste u citologiji.

4. Frakcioniranje ćelija.

5. Radio autoografija.

6. Određivanje trajanja nekih faza ćelijskog ciklusa radioautografijom.

Citologija je nauka o ćeliji. Izdvajao se iz okruženja drugih bioloških nauka prije skoro 100 godina. Po prvi put, generalizovane informacije o strukturi ćelija prikupljene su u knjizi J.-B. Carnoyeva Biologija ćelije, objavljena 1884. Savremena citologija proučava strukturu ćelija, njihovo funkcionisanje kao elementarnih živih sistema: proučavaju se funkcije pojedinih ćelijskih komponenti, procesi ćelijske reprodukcije, njihova popravka, prilagođavanje uslovima okoline i mnogi drugi procesi koji omogućavaju suđenje svojstva i funkcije zajedničke za sve ćelije. Citologija takođe razmatra strukturne karakteristike specijalizovanih ćelija. Drugim riječima, moderna citologija je fiziologija ćelije. Citologija je usko povezana sa naučnim i metodološkim dostignućima biohemije, biofizike, molekularne biologije i genetike. Ovo je poslužilo kao osnova za dubinsko proučavanje ćelije već sa stanovišta ovih nauka i nastanak određene sintetičke nauke o ćeliji - ćelijske biologije, ili ćelijske biologije. Trenutno se termini citologija i ćelijska biologija poklapaju, budući da je njihov predmet proučavanja ćelija sa sopstvenim obrascima organizacije i funkcionisanja. Disciplina "Biologija ćelije" odnosi se na temeljne dijelove biologije, jer istražuje i opisuje jedinu jedinicu cijelog života na Zemlji - ćeliju.

Dugo i pomno proučavanje ćelije kao takve dovelo je do formulacije važne teorijske generalizacije od opšteg biološkog značaja, odnosno do pojave ćelijske teorije. U 17. vijeku Robert Hooke, fizičar i biolog velike genijalnosti, napravio je mikroskop. Ispitujući tanak dio plute pod svojim mikroskopom, Hooke je otkrio da je izgrađen od sićušnih praznih ćelija odvojenih tankim zidovima, koje se, kako sada znamo, sastoje od celuloza. On je ove male ćelije nazvao ćelijama. Kasnije, kada su drugi biolozi počeli da ispituju biljna tkiva pod mikroskopom, pokazalo se da se male ćelije koje je Hooke pronašao u mrtvoj osušenoj pluti nalaze i u živim biljnim tkivima, ali nisu prazne, već svaka sadrži malo želatinozno telo. . Nakon što su životinjska tkiva podvrgnuta mikroskopskom pregledu, ustanovljeno je da se i ona sastoje od malih želatinoznih tijela, ali da su ta tijela rijetko odvojena jedno od drugog zidovima.Kao rezultat svih ovih istraživanja, Schleiden i Schwann su 1939. nezavisno formulisao ćelijsku teoriju, koja kaže da su ćelije elementarne jedinice od kojih su na kraju izgrađene sve biljke i sve životinje. Neko vrijeme je dvostruko značenje riječi ćelija i dalje izazivalo neke nesporazume, ali je tada bilo čvrsto ukorijenjeno u ova mala tela nalik na žele.

Savremeni prikaz ćelije usko je povezan sa tehničkim napretkom i poboljšanjima istraživačkih metoda. Pored konvencionalne svjetlosne mikroskopije, koja nije izgubila svoju ulogu, polarizaciona, ultraljubičasta, fluorescentna i fazno-kontrastna mikroskopija u posljednjih nekoliko decenija dobijaju veliku važnost. Među njima posebno mjesto zauzima elektronska mikroskopija, čija je rezolucija omogućila prodiranje i proučavanje submikroskopske i molekularne strukture ćelije. Savremene metode istraživanja omogućile su da se otkrije detaljna slika ćelijske organizacije.

Svaka ćelija se sastoji od jezgra i citoplazme, odvojenih jedna od druge i od spoljašnje sredine membranama. Komponente citoplazme su: membrana, hijaloplazma, endoplazmatski retikulum i ribozomi, Golgijev aparat, lizozomi, mitohondrije, inkluzije, ćelijski centar, specijalizovane organele.

Dio organizma koji obavlja određenu funkciju naziva se organ. Svaki organ - pluća, jetra, bubreg, na primjer - svaki ima svoju posebnu strukturu, zahvaljujući kojoj igra određenu ulogu u tijelu. Na isti način, postoje posebne strukture u citoplazmi, čija posebna struktura im omogućava da obavljaju određene funkcije neophodne za metabolizam ćelije; ove strukture se nazivaju organele ("mali organi").

Razjašnjenje prirode, funkcije i distribucije citoplazmatskih organela postalo je moguće tek nakon razvoja metoda moderne ćelijske biologije. Najkorisnije u tom pogledu bile su: 1) elektronska mikroskopija; 2) ćelijsko frakcionisanje, pomoću koje biohemičari mogu izolovati relativno čiste frakcije ćelija koje sadrže određene organele i tako proučavati pojedinačne metaboličke reakcije koje ih zanimaju; 3) radioautografiju, koja je omogućila direktno proučavanje pojedinačnih metaboličkih reakcija koje se dešavaju u organelama.

Metoda kojom se organele izoluju iz ćelija naziva se frakcionisanje. Ova metoda se pokazala vrlo plodnom, dajući biohemičarima priliku da izoluju različite ćelijske organele u relativno čistom obliku. Također omogućava određivanje kemijskog sastava organela i enzima koji se u njima nalaze i na osnovu dobivenih podataka izvode zaključke o njihovim funkcijama u ćeliji. Kao prvi korak, ćelije se uništavaju homogenizacijom u nekom pogodnom mediju koji čuva organele i sprečava njihovo agregiranje, a za to se vrlo često koristi rastvor saharoze. Iako mitohondrije i mnoge druge ćelijske organele ostaju netaknute, membranski spletovi kao što su endoplazmatski retikulum i plazma membrana su fragmentirani. Međutim, nastali fragmenti membrane često se zatvaraju sami, što rezultira zaobljenim mjehurićima različitih veličina.

U sljedećoj fazi, ćelijski homogenat se podvrgava nizu centrifugiranja, čija se brzina i trajanje svaki put povećavaju; ovaj proces se naziva diferencijalno centrifugiranje. Različite ćelijske organele se talože na donje epruvete za centrifugiranje pri različitim brzinama centrifugiranja, ovisno o veličini, gustoći i obliku organela. Dobijeni precipitat se može uzorkovati i ispitati. Velike, guste strukture kao što su jezgra talože se najbrže, dok manje, manje guste strukture, kao što su vezikule endoplazmatskog retikuluma, zahtijevaju veće stope i duže vrijeme. Stoga, pri malim brzinama centrifugiranja, jezgra se talože, dok ostale ćelijske organele ostaju u suspenziji. Pri većim brzinama talože se mitohondrije i lizosomi, a dugim centrifugiranjem i vrlo velikim brzinama talože se čak i tako male čestice kao što su ribozomi. Precipitati se mogu ispitati pomoću elektronskog mikroskopa kako bi se odredila čistoća rezultujućih frakcija. Sve frakcije su u određenoj mjeri kontaminirane drugim organelama. Ako je ipak moguće postići dovoljnu čistoću frakcija, onda se one podvrgavaju biohemijskoj analizi kako bi se odredio hemijski sastav i enzimska aktivnost izolovanih organela.

Relativno nedavno stvorena je još jedna metoda frakcioniranja ćelija - centrifugiranje u gradijentu gustine; istovremeno se vrši centrifugiranje u epruveti, u kojoj se prvo slojevito nanose jedan na drugi rastvori saharoze sve veće koncentracije, a samim tim i sve veće gustine. Tokom centrifugiranja, organele sadržane u homogenatu nalaze se u epruveti za centrifugiranje na nivoima na kojima se nalaze rastvori saharoze, koji im odgovaraju po gustini. Ova metoda daje biohemičarima priliku da odvoje organele iste veličine, ali različite gustine (slika 1.).

Autoradiografija je relativno nova metoda koja je neizmjerno proširila mogućnosti svjetlosne i elektronske mikroskopije. Ovo je vrlo moderna metoda, zbog razvoja nuklearne fizike, koja je omogućila dobivanje radioaktivnih izotopa različitih elemenata. Za radioautografiju, posebno, izotopi onih elemenata koje koristi ćelija ili se mogu vezati za supstance koje ćelija koristi, a koji se mogu davati životinjama ili dodati kulturama u količinama koje ne ometaju normalan ćelijski metabolizam. Budući da radioaktivni izotop (ili tvar označena njime) sudjeluje u biokemijskim reakcijama na isti način kao i njegov neradioaktivni parnjak, a istovremeno emituje zračenje, put izotopa u tijelu može se pratiti pomoću razne metode detekcija radioaktivnosti. Jedan od načina otkrivanja radioaktivnosti zasniva se na njenoj sposobnosti da djeluje na fotografski film poput svjetlosti; ali radioaktivno zračenje prodire u crni papir koji se koristi za zaštitu filma od svjetlosti i ima isti učinak na film kao i svjetlost.

Kako bi se na preparatima namijenjenim proučavanju pomoću svjetlosnog ili elektronskog mikroskopa moglo detektirati zračenje koje emitiraju radioaktivni izotopi, preparati se u mračnoj prostoriji prekrivaju posebnom fotografskom emulzijom, nakon čega se ostavljaju neko vrijeme u mraku. Zatim se preparati razvijaju (također u mraku) i fiksiraju. Područja lijeka koji sadrže radioaktivne izotope utječu na emulziju koja leži iznad njih, u kojoj se pod djelovanjem emitiranog zračenja pojavljuju tamna "zrnca". Tako dobijaju radio-autograme (gr. radio- blistav autos- sebe i grapho- pisati).

U početku su histolozi imali samo nekoliko radioaktivnih izotopa; na primjer, radioaktivni fosfor je korišten u mnogim ranim studijama koje su koristile autoradiografiju.Kasnije je korišteno mnogo više ovih izotopa; Radioaktivni izotop vodika, tricij, našao je posebno široku primjenu.

Radio-autoografija je bila i još uvijek se vrlo široko koristi za proučavanje gdje i kako se određene biohemijske reakcije javljaju u tijelu.

Hemijska jedinjenja označena radioaktivnim izotopima koja se koriste za proučavanje bioloških procesa nazivaju se prekursori.Prekursori su obično supstance slične onima koje telo dobija iz hrane; oni služe kao gradivni blokovi za izgradnju tkiva i ugrađeni su u složene komponente ćelija i tkiva na isti način na koji su neobilježeni gradivni blokovi ugrađeni u njih. Komponenta tkiva u koju je ugrađen označeni prekursor i koja emituje zračenje naziva se proizvod.

Ćelije uzgojene u kulturi, iako istog tipa, bit će u različitim fazama ćelijskog ciklusa u bilo kojem trenutku, osim ako se ne preduzmu posebne mjere za sinhronizaciju njihovih ciklusa. Međutim, ubrizgavanjem tricijum-timidina u ćelije, a zatim pravljenjem autograma, moguće je odrediti trajanje različitih faza ciklusa. Vrijeme početka jedne faze - mitoze - može se odrediti bez označenog timidina. Da bi se to postiglo, uzorak ćelija iz kulture se posmatra u fazno-kontrastnom mikroskopu, što omogućava direktno praćenje tijeka mitoze i postavljanje njenog vremena. Trajanje mitoze je obično 1 sat, iako u nekim tipovima ćelija traje i do 1,5 sat.

Definicija trajanjaG2-period.

Za određivanje trajanja G 2 perioda, metod poznat kao oznaka impulsa: u ćelijsku kulturu se dodaje obilježeni timidin i nakon kratkog vremena medij za kulturu se zamjenjuje svježim kako bi se spriječila dalja apsorpcija označenog timidina od strane stanica. U ovom slučaju, oznaka je uključena samo u one ćelije koje su tokom kratkog boravka u medijumu sa tricijum-timidinom bile u S-periodu ćelijskog ciklusa. Udio takvih ćelija je mali i samo mali dio ćelija će dobiti oznaku. Osim toga, sve ćelije koje uključuju oznaku bit će u interfazi – od ćelija koje su upravo ušle u S-period do onih koje su ga skoro završile tokom vremena izlaganja tricijum-timidinu. U uzorku uzetom neposredno nakon uklanjanja obilježenog timidina, oznaka se nalazi samo u interfaznim jezgrama koji pripadaju ćelijama koje su bile u S-periodu tokom perioda izlaganja obilježju; iste ćelije koje su bile u stanju mitoze tokom ovog perioda ostaju neobeležene.

Ako zatim nastavite uzimati uzorke iz kulture u određenim intervalima i dati radioautogram za svaki sljedeći uzorak, tada će doći trenutak kada će se oznaka početi pojavljivati ​​u mitotičkid-hromozomi. Oznake će biti uključene u sve one ćelije koje su bile u S-periodu za vrijeme prisustva tricij-timidina u mediju, a među tim ćelijama će biti i onih koje su tek ušle u S-period i onih koje su ga skoro završile. . Sasvim je očito da će ove posljednje biti prve među obilježenim stanicama koje će proći mitozu i, posljedično, oznaka će se naći u njihovim mitotičkim hromozomima. Dakle, interval između 1) vremena kada je označeni timidin uklonjen iz kulture i 2) vremena pojave obeleženih mitotičkih hromozoma odgovaraće trajanju G 2 perioda ćelijskog ciklusa.

Definicija trajanjaS-period.

S obzirom da će ćelije koje se nalaze na samom kraju S-perioda u trenutku kada se oznaka unese u podlogu prve ući u mitozu, onda će, posljedično, u one ćelije u kojima S-period počinje neposredno prije oznake je uklonjen, označeni mitotički hromozomi će se pojaviti posljednji. Stoga, kada bismo mogli odrediti interval između ulaska u mitozu ćelija koje su prve označene i ćelija koje su obilježene posljednje, ustanovili bismo trajanje S-perioda. Međutim, iako je lako utvrditi vrijeme kada se prvi put pojavljuju obilježeni mitotički hromozomi, vrijeme ulaska u mitozu posljednje obilježenih ćelija ne može se odrediti (ovo je spriječeno vrlo velikim brojem označenih ćelija koje se dijele u posljednjim uzorcima). Stoga se trajanje S-perioda mora odrediti na drugačiji način.

U proučavanju radioautografa uzastopnih uzoraka ćelija uzetih u pravilnim intervalima, otkriveno je da se udio ćelija koje nose oznaku u svojim mitotičkim hromozomima postepeno povećava dok doslovno sve ćelije koje se dijele ne budu označene. Međutim, kako stanice dovršavaju mitozu jednu po jednu, one postaju označene interfazne stanice. Mitozu prve završavaju one označene ćelije koje su prve ušle u nju; i, shodno tome, od ćelija sa obeleženim mitotičkim hromozomima, poslednje završavaju mitozu one koje su poslednje ušle u nju. Pošto je trajanje mitoze uvijek isto, onda, dakle, ako bismo mogli odrediti interval između: 1) vremena završetka mitoze u ćelijama koje su prve uključile etiketu i 2) vremena završetka mitoze. mitoze u ćelijama koje su se poslednje uključile, utvrdili bismo trajanje S-perioda. Nije teško odrediti period određivanjem intervala između: 1) trenutka kada 50% mitotičkih ćelija u kulturi su označene, i 2) vrijeme nakon kojeg kultura više ne sadrži 50% obilježenih ćelija.

Određivanje vremena generisanja (ukupno trajanje čitavog ćelijskog ciklusa).

Nastavkom uzimanja uzoraka ćelija iz kulture, može se otkriti da označene mitotičke figure u nekom trenutku potpuno nestaju, a zatim se ponovo pojavljuju. Takve ćelije koje se dijele su ćelije kćeri izvedene iz onih matičnih ćelija koje su uključile oznaku, a nalaze se u S-periodu u vrijeme izlaganja tricij-timidinu. Ove matične ćelije su ušle u S-period, podijelile se, a zatim prošle kroz drugu interfazu i drugu diobu, odnosno prošle su kroz jedan kompletan ciklus i dio sljedećeg. Vrijeme potrebno da se završi kompletan ćelijski ciklus naziva se vrijeme. generacije. Odgovara intervalu između dva uzastopna vrha uključivanja etikete i obično odgovara segmentu između onih tačaka uzastopnih uzlaznih krivulja u kojima 50% mitotičkih figura sadrži oznaku.

Književnost.

A. Ham, D. Kormak "Histologija", tom 1 Moskva "MIR" 1982;

M.G. Abramov "Klinička citologija" Moskva "MEDICINA" 1974;

Yu.S. Chentsov "Opća citologija"